本研究由来自绵阳师范学院生命科学与技术学院的刘磊、张媛媛、杜保国、王茜，绵阳师范学院林草灾害防治与安全研究中心的蒋雪、马云龙，绵阳师范学院四川省生态安全与保护重点实验室的刘梅、杨景天，以及红河学院云南省南部特色生物资源研究利用重点实验室的付洪波（通讯作者）共同完成。研究论文《Uncovering nutritional metabolites and candidate genes involved in flavonoid metabolism in Houttuynia cordata through combined metabolomic and transcriptomic analyses》发表于学术期刊《Plant Physiology and Biochemistry》第203卷（2023年），于2023年9月27日在线发表。

该研究属于植物生理学与代谢组学、转录组学交叉领域，主要聚焦于药用植物鱼腥草中类黄酮的代谢调控机制。鱼腥草是一种在亚洲广泛用作药食两用的多年生草本植物，其诸多健康益处，如抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒等，被认为与其富含的类黄酮化合物密切相关。然而，不同种质资源间类黄酮含量和组成存在显著差异，其生物合成与代谢调控的分子机制尚不清楚。因此，本研究旨在通过联合代谢组学和转录组学分析，系统揭示两个类黄酮含量差异显著的鱼腥草材料（编号6#和7#）中类黄酮代谢物的组成差异，鉴定影响类黄酮积累的关键候选基因，从而为深入理解鱼腥草类黄酮代谢的分子机制、筛选高药用价值品种及定向育种提供理论基础和参考依据。

研究的详细工作流程主要包括以下几个核心环节： 首先，在材料准备阶段，研究人员从四川雅安和温江分别收集了具有不同表型和类黄酮含量的两个鱼腥草种质（6#和7#），并在绵阳师范学院的实验农场进行了为期两年的统一栽培管理，以确保环境条件的一致性。取样时，采集了两个材料的地上部分（茎和叶），立即液氮速冻后保存于-80°C备用。 其次，进行代谢组学分析。研究人员使用超高效液相色谱-串联质谱技术对样本进行了非靶向代谢物分析。具体流程包括：将冻干样品研磨成粉，用70%甲醇溶液进行超声辅助提取，离心取上清液并过滤。上机分析采用安捷伦SB-C18色谱柱，以0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈作为流动相进行梯度洗脱，质谱检测采用电喷雾离子源，以多反应监测模式进行定量。数据分析基于Metware自建数据库进行代谢物定性与定量，并通过主成分分析、层次聚类分析等方法筛选两个材料间的差异代谢物。本研究共鉴定出397种代谢物，其中类黄酮化合物多达220种。 第三，进行转录组学分析。从相同样本中提取总RNA，检测合格后，使用Illumina NovaSeq 6000平台进行高通量测序。测序数据经过质控后，使用DESeq2软件包进行两个材料间的差异表达基因分析，筛选标准为|log2FoldChange| ≥ 1且错误发现率（False Discovery Rate, FDR）< 0.05。同时，对差异表达基因进行了KEGG通路富集分析，重点关注与类黄酮代谢相关的通路。 第四，构建代谢网络与关键基因筛选。研究人员将代谢组学鉴定出的差异类黄酮代谢物与转录组学发现的差异表达基因进行关联分析。他们绘制了类黄酮代谢网络图，将特定代谢物含量的变化趋势与其合成途径上游相关基因的表达水平进行关联和趋势一致性比较。在此基础上，结合已有的知识，筛选出可能调控关键类黄酮代谢物合成的候选基因。 第五，候选基因的验证。为了验证转录组数据的可靠性及候选基因的功能，研究者选取了8个候选基因进行实时荧光定量PCR分析，以在mRNA水平上确认它们在两个材料中的表达差异模式，并与转录组测序结果进行对比验证。

研究获得的主要结果如下： 在代谢物层面，两个材料的总类黄酮含量存在极显著差异，7#（9.21 mg/g）显著高于6#（2.94 mg/g）。共鉴定出220种类黄酮代谢物，分为花青素、查耳酮、黄烷醇、黄烷酮、二氢黄酮醇、黄酮和黄酮醇七大类，其中黄酮醇和黄酮是主要类别，占比超过70%。主成分分析显示，矢车菊素-3-O-芸香糖苷和槲皮素-3-O-半乳糖苷是两个材料中含量最丰富的类黄酮。通过差异分析，共鉴定出112种在两个材料间含量存在显著差异的类黄酮代谢物，其中67种在7#中高积累，45种在6#中高积累。值得注意的是，三种黄酮类化合物——松属素-7-O-新橙皮糖苷、松属素-7-O-芸香糖苷和山奈酚-3-O-半乳糖苷-4’-O-葡萄糖苷仅在7#中被检测到，这可能是7#具有更高药用或食用开发潜力的特征代谢物。KEGG通路富集分析将19种已注释的差异类黄酮代谢物映射到三个类黄酮生物合成相关通路：类黄酮生物合成、花青素生物合成、以及黄酮和黄酮醇生物合成。 在基因层面，转录组分析揭示了与类黄酮代谢相关的110个差异表达基因。其中，更多基因在7#材料中呈现高表达（75个上调，35个下调）。对这些基因进行KEGG通路归属分析，发现它们涉及类黄酮生物合成、花青素生物合成、异黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成以及苯丙氨酸代谢等五条通路。特别地，研究人员分析了可能调控类黄酮生物合成的关键转录因子，发现分别有93个bHLH和228个MYB转录因子在两个材料间差异表达，其中大部分在7#中高表达，暗示它们可能正向调控类黄酮的合成。 通过整合代谢组与转录组数据构建的代谢网络分析，研究成功将特定代谢物的积累变化与特定基因的表达关联起来。例如，研究发现在7#中高积累的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（一种花青素）与一个高表达的花色素合酶基因的表达趋势一致，推测ANS基因在调控该花青素合成中起重要作用。对于黄酮醇类物质，如山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷等在7#中高积累的化合物，其含量变化与两个黄酮醇合酶基因的高表达趋势相符；而槲皮素-3-O-桑布双糖苷和山奈酚在6#中高积累，则与另外两个FLS基因在6#中的高表达趋势一致。类似地，一些黄酮类代谢物（如木犀草素、芹菜素糖苷等）的含量差异可能与两个类黄酮3’-羟化酶基因的表达模式相关联。实时荧光定量PCR结果成功验证了其中8个关键候选基因（包括CHS、CHI、F3‘H、FLS、ANS等）在两个材料中的差异表达模式，与转录组数据高度吻合，增强了结果的可靠性。

本研究得出结论：两个鱼腥草种质在类黄酮组成和含量上存在显著的种内变异。材料7#具有更高的总类黄酮含量，并且含有三种独特的黄酮类化合物，显示出更高的药用和食用开发潜力。通过多组学联合分析，成功鉴定了调控不同类别类黄酮（如花青素、黄酮、黄酮醇）积累的关键候选基因，例如ANS基因可能调控矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的合成，而不同的FLS基因则分别负责调控不同黄酮醇的积累水平。这些发现为解析鱼腥草类黄酮代谢的分子机制提供了重要见解。

该研究的科学价值和应用价值主要体现在：首先，系统揭示了鱼腥草种质资源间类黄酮代谢物的多样性，为评价和筛选优良种质提供了代谢物层面的依据。其次，首次在鱼腥草中通过整合代谢组与转录组数据，构建了类黄酮代谢网络，并鉴定出多个与关键代谢物积累相关的候选基因，将代谢表型与基因型有效关联，深化了对该物种次生代谢调控机制的理解。最后，研究结果为通过分子标记辅助选择或基因工程手段培育高类黄酮含量的鱼腥草新品种提供了潜在的基因靶点和理论指导，具有重要的应用前景。

本研究的亮点包括：第一，研究方法的创新性，采用了非靶向代谢组学与转录组学相结合的“多组学”策略，全面、系统地解析了鱼腥草类黄酮代谢的化学基础与分子基础。第二，研究对象的特殊性，聚焦于具有重要药食价值的传统植物鱼腥草，针对其活性成分（类黄酮）的种内变异机制进行深入探究，填补了该领域分子机制研究的空白。第三，研究结果的启发性，不仅发现了含量差异，还鉴定出仅在某一材料中存在的特征代谢物，并成功将多个具体代谢物的积累变化趋势与特定结构基因的表达模式相关联，使结论更加具体和具有说服力。第四，验证环节的严谨性，通过qPCR对候选基因进行了独立验证，增强了转录组数据的可靠性。

此外，研究中关于转录因子（MYB和bHLH）的差异表达分析也颇具价值，提示了在转录调控层面可能存在的复杂网络，为后续研究类黄酮合成的上游调控机制提供了线索。总体而言，这项研究是一项数据详实、逻辑清晰、具有重要理论和实践意义的系统性工作。