本研究的主要作者为哈尔滨医科大学附属第二医院骨科张思琪、张岩、王肖燕、李欣晨、闫景龙、陈广华、姬晔，以及哈尔滨工业大学的赵伟和北京大学深圳医院的宋丽丽。该研究以《A biomimetic physical-biological coupled bone organoid 3D culture system for bone repair》为题，发表于Materials Today Advances期刊，并于2026年2月23日在线发表。
一、研究背景与目的 该研究属于生物医学工程与骨组织工程交叉领域。临床上由感染、肿瘤和外伤导致的大面积骨缺损是骨科治疗的重大挑战。自体骨移植虽是“金标准”，但存在供量有限、供区损伤等问题。因此，开发能够有效促进骨再生与修复的替代材料至关重要。骨组织是高度血管化的承重器官，修复过程涉及复杂的成骨与成血管耦合机制。现有的骨组织工程（Bone Tissue Engineering， BTE）支架在促进血管化方面面临挑战，例如生长因子持续释放困难、细胞活性维持不佳等。因此，研究旨在开发一种新型的、能够同时模拟骨骼物理结构和生物微环境的“类器官”三维（3D）培养系统，以协同增强血管化和骨再生，为骨缺损修复提供更优化的平台。
二、详细研究流程 本研究是一项综合性的原创研究，涵盖了从材料设计、制造、表征到体外细胞实验、体内动物实验，以及最终利用深度学习进行数据整合分析的完整工作流。
1. 仿生3D培养系统的设计与制备 * 研究目标：构建一个物理-生物耦合的仿生骨类器官3D培养支架。 * 具体流程： * 支架设计与制造：利用计算机辅助设计生成模仿骨小梁结构的梯度孔隙结构模型，采用3D打印技术，使用含有羟基磷灰石（Hydroxyapatite， HA）颗粒的生物墨水，通过喷墨式打印机逐层制造。打印后的生胚经过400°C预烧结和1200°C高温烧结，最终形成具有多级孔隙结构的刚性HA支架。 * 水凝胶生物墨水制备：选用甲基丙烯酸化明胶（Gelatin methacryloyl， GelMA）作为光敏水凝胶的主要成分，因其能提供类似细胞外基质的结构。将人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs）悬浮于GelMA溶液中，并同时加载促血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）和促骨形态发生蛋白-2（Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2）两种关键生长因子，形成“预血管化”生物墨水。 * 复合支架组装：将切割好的3D打印HA支架置于培养板中，注入含有细胞和生长因子的GelMA溶液，使其充分渗透到支架孔隙中。随后使用405 nm波长的紫外光照射30秒，使GelMA光交联固化，从而将细胞和因子固定在HA支架的内部三维空间中，形成最终的“HA-水凝胶”复合支架（文中称为SC-Gel组），而仅有HA的支架作为2D培养对照（SC组）。
2. 材料表征与性能分析 * 研究目标：验证所制备支架的物理化学特性、结构仿生性及力学性能。 * 具体流程与对象：对制备的HA支架（样本数量未明确，但实验重复进行）进行了以下分析： * 结构表征：使用微计算机断层扫描（Micro-CT）进行三维重建，观察孔隙连通性；使用扫描电子显微镜（SEM）在不同放大倍数（100倍， 2000倍， 20000倍）下观察表面形貌和微观结构；使用能量色散X射线光谱（EDX）分析元素组成；使用X射线衍射（XRD）分析晶体结构，确认主要成分为羟基磷灰石。 * 力学性能测试：使用万能材料试验机进行压缩试验，获取压缩强度、模量等数据。 * 有限元分析（Finite Element Analysis, FEA）：使用商业FEA软件对支架模型进行流体动力学和固体力学模拟。流体模拟基于达西定律计算绝对渗透率，分析营养物质在支架内部的流动分布和速度矢量场；固体力学模拟分析支架在负载下的冯·米塞斯应力分布，预测其力学承载特性。这是一种预计算和理论验证方法，用于证明支架设计的仿生形态学优势。
3. 体外细胞实验 * 研究目标：评估复合支架的生物相容性、促进成骨和成血管的能力。 * 具体流程与对象： * 生物相容性评估： * 细胞活力：将HUVECs与不同材料成分（PBS对照、HA支架、GelMA水凝胶、HA-GelMA复合支架）共培养24小时后，使用CCK-8法检测细胞活力和增殖情况。 * 细胞存活与分布：使用活/死细胞染色试剂盒（钙黄绿素-AM/PI）对在SC和SC-Gel支架上培养的细胞进行染色，通过荧光显微镜观察细胞在支架上的存活状态和三维空间分布。 * 细胞形态定量分析：这是一项创新性的分析方法。研究人员使用ImageJ软件对荧光显微镜拍摄的细胞图像进行后处理。通过中值滤波、阈值分割、分水岭算法等步骤分割单个细胞单元，并计算了一系列几何、形状和空间分布参数，包括各向异性、伸长率、细胞面积、细胞间距离、粗糙度、等效直径等。这些参数用于定量比较2D（SC组）和3D（SC-Gel组）培养环境下细胞形态的差异。 * 成骨能力评估：使用骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCs）进行实验。 * 碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红S（ARS）染色：将BMSCs在各组支架浸提液中培养后，进行ALP（早期成骨标志）和ARS（钙结节形成，晚期成骨标志）染色，定性评估成骨分化。 * 基因和蛋白水平检测：使用定量实时聚合酶链式反应（qPCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测BMSCs中成骨关键基因（RUNX2， OPN， OCN）和蛋白的表达水平，定量评估成骨分化程度。 * 成血管能力评估：使用HUVECs进行实验。 * 细胞迁移实验： * 划痕实验：在单层HUVECs上制造划痕，用不同支架的浸提液培养，观察24小时后细胞迁移覆盖划痕区域的情况，并用ImageJ定量分析迁移面积。 * Transwell实验：将HUVECs接种于Transwell上室，下室加入含支架浸提液的培养基，培养24小时后，对迁移至下室的细胞进行结晶紫染色和计数。 * 血管生成相关标志物检测：使用ELISA检测HUVECs在支架浸提液培养后，血管生成标志物CD31的蛋白表达水平。 * 体外成管实验：将HUVECs接种于铺有Matrigel的孔板中，并加入支架浸提液，培养6小时后，在显微镜下观察细胞是否形成管状网络结构，并分析节点数和血管总长度。
4. 体内动物实验 * 研究目标：在活体动物模型中验证复合支架促进骨缺损修复和血管生成的效果。 * 具体流程与对象： * 动物模型建立：使用雄性Sprague-Dawley大鼠（>8周龄， 200-250g），在其颅骨顶部制造一个直径5mm的临界尺寸骨缺损模型。 * 分组与植入：将大鼠随机分组，分别植入SC支架（2D对照组）和SC-Gel复合支架（3D实验组）。 * 观察与取样：术后8周处死动物，获取包含缺损区域的颅骨样本。 * 评估方法： * Micro-CT分析：对取样颅骨进行扫描和三维重建，量化分析新骨生成的相关参数，如骨体积分数（BV/TV）、骨密度（BMD）、骨小梁数量（Tb.N）、厚度（Tb.Th）和分离度（Tb.Sp）。同时，利用算法从CT数据中分割和重建出缺损区域内的血管网络，分析血管数量、总长度、总体积以及终末血管与分支血管的比例。 * 组织学分析：样本经脱钙、石蜡包埋、切片后，进行： * 苏木精-伊红（H&E）染色：观察组织整体形态和新骨形成。 * 马松三色（Masson）染色：区分胶原（蓝色）和新形成的骨组织（红色），评估骨组织成熟度。 * CD31免疫组化染色：特异性标记血管内皮细胞，直观显示缺损区域内的新生血管密度和分布。
5. 深度学习数据分析 * 研究目标：建立一个多模态数据融合的深度学习模型，探索定量数据和定性图像之间的潜在关系，进行关键因素分析。 * 具体流程与算法：这是一个本研究的特色分析方法。 * 数据预处理：从体外体内实验获得的定量指标数据（如OD值、基因表达量、CT参数等）被整理、缺失值填补并进行归一化处理。 * 多模型构建与融合： * 定量数据模型（MLP）：构建一个多层感知机（Multilayer Perceptron， MLP）神经网络，输入为51个生物相容性、成骨和成血管相关的定量特征，输出为三个目标预测值。该模型用于从结构化数据中学习规律。 * 定性图像模型（ResNet18）：采用预训练的ResNet18卷积神经网络，对其最后一层进行修改，使其能够输入2D图像（如组织学切片图像、细胞染色图像）并输出与MLP相同的三个预测目标。该模型用于从图像中自动提取形态学特征。 * 决策融合模型（DecisionFusionModel）：开发了一个自定义的融合模型。将MLP和ResNet18各自的预测结果（共6个特征）作为输入，通过一系列全连接层并结合自注意力（Self-Attention）机制，对来自不同模态的预测信息进行动态加权和融合，最终输出更优的联合预测结果。该框架旨在建立一个“定量精度-定性形态”的双维度分析体系。
三、主要研究结果 1. 支架成功构建并具备仿生特性：Micro-CT和SEM证实所制备的HA支架具有均一、贯通的多级孔隙结构（一级孔隙约200μm，二级为微米/纳米级粗糙结构），成功模拟了骨小梁和哈佛系统的结构。EDX和XRD证实其主要成分为羟基磷灰石。FEA模拟显示，支架内部应力主要集中在杆件重叠区域，而流体流动速度在外部较快、内部较缓，这种设计有利于外部快速骨整合和内部稳定的细胞生长环境。
2. 复合支架展现优异的生物相容性和3D培养优势：CCK-8和活/死染色结果表明，HA、GelMA及复合支架均无细胞毒性，且能增强细胞活性。更重要的是，细胞形态定量分析揭示，与2D培养（SC组）相比，在3D培养系统（SC-Gel组）中的细胞表现出更小的细胞面积、更接近球形的立体形态（各向异性和伸长率更低）、更高的细胞密度以及更平滑的细胞轮廓（粗糙度更低）。这些数据证实，该3D系统为细胞提供了一个更接近体内生理状态的立体微环境。
3. 复合支架显著增强成骨能力：体外实验显示，与对照组和SC组相比，SC-Gel组的BMSCs表现出更强的ALP活性、更多的钙结节形成（ARS染色），以及RUNX2、OPN、OCN等成骨标志物在基因和蛋白水平上的更高表达。这表明3D培养系统能更有效地促进BMSCs的成骨分化。
4. 复合支架有效促进成血管能力：体外实验表明，SC-Gel组的浸提液能更有效地促进HUVECs的迁移（划痕愈合面积更大，Transwell迁移细胞数更多）、上调CD31表达，并诱导HUVECs形成更丰富、节点更多、长度更长的管状网络结构。这证明了该预血管化3D系统强大的促血管生成潜能。
5. 体内实验验证协同修复效果：术后8周的Micro-CT分析显示，SC-Gel组的新骨生成量（BV/TV， BMD）、骨整合范围及骨小梁质量均显著优于SC组。血管重建结果显示，SC-Gel组缺损区内形成了更多、更长、更粗且分支比例更高的血管网络，与新生骨区域紧密伴行。组织学染色（H&E， Masson， CD31）进一步证实，SC-Gel组有更连续的新生骨桥、更成熟的胶原沉积以及更密集的新生血管。这些结果有力证明了该3D培养系统在活体内能协同促进血管化和骨再生，从而加速骨缺损修复。
6. 深度学习模型实现有效预测与关联分析：MLP模型对定量数据的预测表现出极高的精度（R² = 0.9931）。ResNet18模型对图像的预测也有良好表现（R² = 0.914）。而融合了二者优势的决策融合模型，通过自注意力机制整合了定量和形态学信息，实现了更稳健的预测（R² = 0.9784）。该框架成功地从复杂的多模态实验数据中挖掘出潜在关联，为理解支架性能与生物学结局之间的关系提供了新的分析工具。
四、研究结论与价值 本研究成功开发并验证了一种新型的仿生物理-生物耦合骨类器官3D培养系统。该系统通过3D打印制造具有仿骨结构的羟基磷灰石支架，并整合了负载细胞和生长因子的GelMA水凝胶，创造了一个高度模拟体内细胞外基质的三维培养环境。
科学价值： 1. 提出并实践了“预血管化骨类器官”构建新策略：将3D打印的硬质支架与承载细胞的水凝胶相结合，实现了从“结构仿生”到“微环境仿生”的跨越，为骨组织工程提供了新的设计思路。 2. 揭示了3D培养系统的形态学优势：通过创新的细胞形态定量分析，首次用数据精确描述了细胞在2D与3D培养环境下的几何学差异，为3D培养的优越性提供了直接证据。 3. 证明了成血管与成骨的协同增强效应：体内外实验一致表明，该复合系统能同时、高效地促进血管网络生成和骨组织再生，且两者在空间和时间上紧密耦合，验证了其在修复大型骨缺损方面的巨大潜力。 4. 引入了多模态深度学习分析框架：将传统生物实验数据与人工智能分析相结合，建立了“定量-定性”双维度分析模型，为复杂生物系统的数据挖掘和机理探索提供了方法论参考。
应用价值：该研究所开发的HA-GelMA复合支架，材料成分（HA， GelMA）生物安全性高，制造工艺（3D打印， 光固化）相对成熟，具有良好的临床转化前景。它有望成为修复临界尺寸骨缺损、尤其是血供不佳区域骨缺损的有效植入物，未来可进一步整合抗菌功能或个性化设计。
五、研究亮点 1. 创新性的系统设计：将仿生结构（HA支架）、仿生基质（GelMA水凝胶）、效应细胞（HUVECs， BMSCs）及信号因子（VEGF， BMP-2）一体化集成，构建了功能耦合的“骨修复类器官”系统。 2. 深入的多尺度表征与验证：从纳米/微米级结构表征、计算机模拟预测，到细胞水平的功能验证（涵盖形态、迁移、分化），再到动物体内的整体疗效评估，形成了完整、严谨的证据链。 3. 先进的细胞形态定量分析方法：超越了传统的定性观察，采用图像处理算法对3D培养下的细胞形态进行精细量化，为评价培养系统优劣提供了新的客观指标。 4. 跨界融合的深度学习分析：在生物医学研究中创新性地应用了包含自注意力机制的多模态深度学习模型，尝试解读数据与图像背后的复杂生物学关系，提升了研究的深度和智能化水平。