这篇研究由Song F. Lee、Yi-Jing Li和Scott A. Halperin合作完成，作者团队来自加拿大达尔豪斯大学（Dalhousie University）的应用口腔科学系、微生物与免疫学系、儿科学系以及加拿大疫苗学中心。研究发表于2009年的《Microbiology》期刊（卷155，页3581-3588），标题为《Overcoming codon-usage bias in heterologous protein expression in Streptococcus gordonii》。

学术背景
本研究聚焦于分子生物学和疫苗开发领域，核心问题是解决链球菌（*Streptococcus*）作为活疫苗载体时外源蛋白表达量不足的瓶颈。背景知识显示：
1. 疫苗载体瓶颈：*Streptococcus gordonii*是口腔共生菌，研究者尝试将其改造为口服疫苗载体，但其外源蛋白（如百日咳毒素S1片段、抗CR1单链抗体等）表达效率低，制约了应用。
2. 密码子使用偏好（codon-usage bias）：细菌对特定密码子的偏好导致某些tRNA丰度不足，若外源基因含高频稀有密码子（rare codons），翻译会因tRNA短缺而停滞，造成蛋白截断或低表达。此前，该问题仅在大肠杆菌（*E. coli*）中被系统研究，且补充稀有密码子tRNA可提升表达量，但链球菌属中尚无相关报道。
3. 研究目标：鉴定链球菌中的稀有密码子，并通过构建携带稀有tRNA基因的质粒（plasmid），验证其能否克服外源蛋白表达限制。

实验流程与方法
1. 稀有密码子鉴定：
- 研究分析了*S. gordonii*及其他7种链球菌（如*S. mutans*、*S. pneumoniae*等）的基因组，筛选出12个使用频率低于15‰的稀有密码子（如CGG、AUA、CCG等）。通过比对E. coli K-12的密码子使用频率，发现9个密码子在链球菌和大肠杆菌中均为稀有，但3个（GCG、CUG、CCG）在链球菌中稀有而在大肠杆菌中高频使用。

1. 质粒构建（ptrna2）：

   • 从商业质粒pRARE2和大肠杆菌XL-1 Blue中克隆10个稀有密码子的tRNA基因（如*argW*、*ileX*、*leuW*等），插入链球菌-大肠杆菌穿梭载体pDL278，构建重组质粒ptrna2。该质粒含17个tRNA基因，其中10个靶向稀有密码子。
     
   • 创新方法：采用多步PCR扩增、限制性酶切（如SstI、SmaI）和连接技术，将tRNA基因模块化组装至载体（图1）。
     

2. 外源蛋白表达验证：

   • 研究对象：选择三种含高比例稀有密码子的外源蛋白——SPA1/S1（百日咳毒素S1片段融合蛋白，稀有密码子占比15.6%）、抗CR1单链抗体（14.0%）、弓形虫Cyclophilin C18（8.1%）。
     
   • 菌株构建：将ptrna2转入以下工程菌株：
     
     • S. gordonii RJM4（染色体整合*spap/s1*基因）、SMI/II-4（仅含*spap*基因对照）；
       
     • S. gordonii SECCR1（携带抗CR1 scFV基因）、SECC18（携带C18基因）；
       
     • S. mutans SECCR1（跨物种验证）。
       
   • 检测方法：
     
     • Western blot：使用抗S1单抗（A4）、抗HA标签抗体等检测蛋白表达量；
       
     • RT-PCR：验证ptrna2中tRNA的转录活性；
       
     • 统计学分析：Student’s t检验比较表达量差异（p<0.05为显著）。
       

主要结果
1. 外源蛋白表达提升：
- SPAP/S1：ptrna2使S. gordonii RJM4的SPAP/S1产量提升2.7倍（p<0.005），而对照菌SMI/II-4（仅含*spap*）无变化，证明S1片段的稀有密码子是限制因素。
- 抗CR1 scFV：在*S. gordonii*中表达量提升120倍（p<0.001），在*S. mutans*中提升4.8倍（p<0.05），表明跨物种有效性。
- C18：表达量增加10倍（p<0.01）。
- 直接可视性：SDS-PAGE显示SPAP/S1和抗CR1 scFV条带强度接近内源蛋白（图2、3、5）。

1. tRNA功能验证：
   
   • RT-PCR证实ptrna2中的10种稀有tRNA均在*S. gordonii*中有效转录（图4），且来源于大肠杆菌的tRNA在链球菌中具有功能性。
     

结论与价值
1. 科学意义：首次在链球菌属中证实密码子使用偏好是外源蛋白表达的主要限制，并通过tRNA补充策略突破这一瓶颈。
2. 应用价值：
- 疫苗开发：提升*S. gordonii*作为疫苗载体的蛋白表达能力，为口服疫苗设计提供新工具；
- 工业生物技术：方案可推广至其他链球菌（如乳酸发酵菌*S. thermophilus*），优化重组蛋白生产。
3. 理论创新：揭示了链球菌与大肠杆菌在密码子使用上的差异（如CUG、CCG频率），为后续研究提供基础数据。

研究亮点
1. 首次发现：链球菌属的密码子使用偏好及其对外源蛋白表达的影响。
2. 方法创新：构建首个链球菌稀有tRNA补充质粒ptrna2，并验证其跨物种有效性。
3. 高效提升：抗CR1 scFV表达量提升120倍，达工业化生产潜力。

其他价值
研究还发现，*S. sanguinis*中CUG和CCG密码子使用频率异常高，提示链球菌种间密码子偏好存在分化，后续可探索其进化意义。