本研究由Jacqueline Horn、Eleonora Tolardo、Davide Fissore和Wolfgang Friess共同完成，主要作者分别来自德国慕尼黑大学（Ludwig-Maximilians-Universität München）药学系和意大利都灵理工大学（Politecnico di Torino）应用科学与技术系。该研究以原创性学术论文的形式发表于《European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics》，于2018年3月5日投稿，2018年9月6日被接收，文章DOI为10.1016/j.ejpb.2018.09.004。

该研究属于制药冻干技术领域，聚焦于生物制药冷冻干燥（freeze-drying，简称FD）过程中赋形剂的选择与工艺优化。冻干技术常用于延长生物药物的货架期，但传统冻干工艺为保证无定形体系的饼块外观（cake appearance），通常需要在低于玻璃化转变温度（glass transition temperature of the maximally freeze-concentrated solution, Tg’）或塌陷温度（collapse temperature, Tc）的条件下进行干燥，导致干燥时间较长。为克服这一限制，研究者尝试使用结晶性赋形剂（bulking agents）作为骨架，使干燥可以在高于无定形相塌陷温度的条件下进行，从而缩短冻干周期。常用的结晶性赋形剂如甘露醇（mannitol, MAN）和甘氨酸（glycine, GLY）虽然可以提供结晶骨架，但它们通常需要较高的赋形剂/稳定剂比例才能保证完全结晶。例如，甘露醇与蔗糖（sucrose, SUC）的重量比通常需要达到4：1。然而，较高的赋形剂比例会减少无定形稳定剂（如蔗糖）在制剂中的比例，从而可能影响蛋白质的长期稳定性。因此，本研究旨在寻找能够在较低赋形剂/稳定剂比例下仍能结晶、并能在高于Tg’的快速冻干条件下保持良好饼块外观的替代性氨基酸赋形剂。

研究团队选择了苯丙氨酸（phenylalanine, PHE）、亮氨酸（leucine, LEU）、异亮氨酸（isoleucine, ILE）和甲硫氨酸（methionine, MET）作为候选氨基酸赋形剂，分别与蔗糖按2.⁵⁄₄₇.5、5/45和10/40的重量比（总固含量50 mg/mL）配制成溶液，并以甘氨酸和甘露醇作为对照。研究工作的主要流程包括以下几个阶段：首先，利用差示扫描量热法（differential scanning calorimetry, DSC）对冷冻浓缩液进行热分析，测定Tg’并观察氨基酸在冷冻过程中的结晶行为。结果显示，PHE/SUC 10/40、ILE/SUC 10/40、LEU/SUC 10/40和MET/SUC 10/40在升温扫描中均出现放热结晶峰，表明这些氨基酸在冷冻浓缩液中具有结晶倾向，但结晶可能不完全。其次，研究团队在两种冻干循环条件下对制剂进行冻干：一种为含退火（annealing）步骤的循环，另一种为不含退火步骤的快速循环，两种循环均采用2.2 mbar的仓室压力和高于Tg’的产品温度。冻干后，通过宏观外观和数字显微镜评估饼块结构，利用X射线粉末衍射（X-ray powder diffraction, XRPD）检测结晶性，并通过DSC测定冻干饼块的玻璃化转变温度（Tg），Karl-Fischer滴定法测定残余水分（residual moisture, RM），以及测定复溶时间。结果显示，PHE、LEU和ILE在5/45和10/40的氨基酸/蔗糖比例下均能形成可接受的饼块外观和明显的氨基酸结晶峰，而2.⁵⁄₄₇.5比例下虽然部分氨基酸仍能结晶，但饼块收缩明显。退火步骤未能进一步改善结晶或饼块外观。由于在2.2 mbar下冻干的饼块出现底部脱离现象，研究团队进一步优化冻干工艺，将仓室压力降低至0.52 mbar，产品温度由-10°C降至-20°C，并增加一组0.40 mbar、搁板温度0°C的循环作为对照。结果表明，0.52 mbar压力下可避免饼块抬起，同时保持氨基酸结晶和较好的饼块外观，且残余水分较低，Tg值较高。而0.40 mbar条件下的较低产品温度抑制了部分氨基酸的结晶。在工艺优化后，研究团队进一步考察了pH对制剂物理特性的影响，发现pH 5至7范围内对饼块外观和氨基酸结晶影响较小，而极端pH条件下会导致饼块塌陷或氨基酸晶型改变。此外，为改善ILE和LEU制剂复溶时间较长的问题，研究者尝试了多种方法，包括调整复溶介质的pH、改变样品瓶内压力、在复溶介质或制剂中加入表面活性剂。结果表明，在制剂中加入0.02%或0.2%聚山梨酯80（polysorbate 80, PS80）可显著缩短ILE/SUC 10/40的复溶时间，但高浓度PS80可能导致饼块收缩或诱导蔗糖结晶。因此，后续蛋白质实验中选择0.04%聚山梨酯20（polysorbate 20, PS20）作为折中方案。

在蛋白质稳定性研究中，研究团队使用一种单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）作为模型蛋白，分别在2 mg/mL和50 mg/mL两种浓度下与PHE/SUC、ILE/SUC和LEU/SUC按5/45和10/40比例制备制剂，并在0.52 mbar条件下冻干。冻干后对制剂进行了宏观外观、XRPD、Tg、残余水分、复溶时间以及蛋白质聚集体的分析。结果显示，50 mg/mL mAb的所有制剂均具有良好的饼块外观，且ILE和LEU在两种蛋白浓度下均保持结晶，而PHE的结晶在50 mg/mL mAb浓度下被完全抑制。2 mg/mL mAb浓度下，LEU/SUC 5/45的饼块外观最好，ILE/SUC 5/45次之，而PHE/SUC 5/45出现收缩。蛋白质稳定性方面，通过紫外-可见光谱法（UV-vis spectroscopy）、光阻法（light obscuration, LO）和高效分子排阻色谱（high performance size exclusion chromatography, HP-SEC）检测，未发现冻干过程引起的不溶性聚集体、亚可见颗粒增加或可溶性聚集体显著上升。

本研究的结论是，PHE、LEU和ILE作为结晶性赋形剂可在5/45和10/40的氨基酸/蔗糖比例下，在明显高于Tg’的产品温度（-20°C）下进行快速冻干，并获得优于甘露醇和甘氨酸的饼块外观和结晶性。特别是ILE和LEU的结晶不易受蛋白质浓度抑制，这使其成为替代甘露醇的理想候选。研究还表明，退火步骤对该体系并非必需，而产品温度和仓室压力对氨基酸结晶和饼块质量有显著影响。该研究的主要意义在于为低赋形剂/高稳定剂比例的冻干制剂提供了新的配方策略，既保证了快速冻干工艺的可行性，又维持了足够的无定形稳定剂以保护蛋白质。

本研究的亮点在于：系统比较了多种氨基酸在低比例条件下作为赋形剂的结晶行为，发现ILE和LEU在蛋白质存在下仍能保持结晶，突破了传统结晶赋形剂易受蛋白质抑制的限制；优化了冻干工艺参数，在不使用退火步骤的情况下实现了较好的饼块外观和低残余水分；还通过表面活性剂的加入改善了疏水性氨基酸制剂的复溶性能。这些发现为生物制药冻干制剂的开发提供了新的思路和实验依据。