本研究由Varun R. Potlapalli等人担任第一作者，通讯作者为Jessica T. Lin，主要研究机构包括北卡罗来纳大学教堂山分校（University of North Carolina School of Medicine）全球健康与传染病研究所、坦桑尼亚Muhimbili健康与联合科学大学、喀麦隆Dschang大学等。论文于2023年12月8日发表在开放获取期刊《PLOS Neglected Tropical Diseases》上，标题为“Real-time PCR detection of mixed Plasmodium ovale curtisi and wallikeri infections in human and mosquito hosts”。

一、学术背景与研究目的

疟疾仍然是全球重要的公共卫生问题。其中，卵形疟原虫（Plasmodium ovale）传统上被认为是一个单一物种，但分子生物学证据已将其明确划分为两个完全独立、不发生基因重组的隐存种：库氏卵形疟原虫（Plasmodium ovale curtisi，简称Poc）和沃氏卵形疟原虫（Plasmodium ovale wallikeri，简称Pow）。二者在显微镜下形态极为相似，无法通过镜检区分。近年来的分子流行病学调查显示，这两种疟原虫在撒哈拉以南非洲地区的流行率正逐步上升，且常常呈现同域分布（sympatric distribution）。然而，一个令人困惑的现象是，尽管其他疟原虫（如恶性疟原虫与间日疟原虫）的混合感染屡见不鲜，文献中报告的Poc和Pow在同一宿主体内的混合感染却异常罕见——在超过35项研究、总计1515例卵形疟病例中，混合感染报道不足20例。

研究团队推测，这种“罕见”并非真实的生物学屏障所致，而是源于现有检测技术的局限性。许多已有的分子检测方法灵敏度不足，或者在针对两个物种时存在交叉反应（cross-reactivity），难以准确识别出混合感染。尤其是当其中一个物种处于低密度时，极易被漏检。为此，该研究旨在：第一，改良已有的实时荧光定量PCR（real-time qPCR）检测方法，建立一套能够同时检测并区分Poc和Pow的分析流程；第二，通过模拟实验制定混合感染判定的算法，以避免假阳性；第三，将优化后的方法应用于现场采集的人血样本和蚊虫样本，揭示Poc/Pow混合感染在人类及蚊媒宿主中的真实发生频率。

二、研究工作流程与实验方法

研究整体分为三大部分：分子检测方法的改良与优化、模拟混合感染体系的验证与算法构建、以及临床与蚊虫样本的应用评估。

1. 分子检测方法的改良
   研究团队首先系统回顾了已发表的Poc/Pow区分方法（见表1），最终选择了两个基于18S核糖体RNA基因（18S rRNA）的检测体系：Calderaro等人发表的巢式PCR（nested PCR，简称npcr）和Perandin等人发表的real-time qPCR。18S rRNA基因在疟原虫基因组中具有多拷贝数（约6个拷贝/基因组），有利于提高检测灵敏度。

针对巢式PCR，研究者通过增加扩增循环数（两轮合计最高达到85个循环）、降低第二轮退火温度以及增加模板DNA体积等方式，显著提高了其扩增成功率。

针对real-time qPCR，原有检测Poc和Pow的体系分别使用了独立的引物和探针，但其反向引物完全相同，而正向引物及探针各自仅相差两个核苷酸。若在同一管内进行双重PCR（duplex PCR），严重的交叉反应会导致无法区分物种。因此，研究团队采取了“平行单重检测”的策略，即在同一块PCR板上、相同的热循环条件下，用两个独立的反应体系分别检测Poc和Pow。经过试验，将退火温度统一调整为52.8°C，并将循环数由原先的45个增加至50个，以充分挖掘低丰度靶标的检测潜力。

1. 检测性能评估与混合感染判定算法
   为了精确测定改良qPCR的灵敏度与特异性，研究者使用了含有Poc和Pow 18S rRNA插入片段的质粒标准品进行10倍梯度稀释（范围10⁵至10⁻¹拷贝/μl）。每个浓度梯度重复检测多次，并使用Probit回归分析计算最低检测限（limit of detection）。结果显示，Poc检测的95%可信下限为0.6质粒拷贝/μl（相当于约0.1寄生虫/μl），Pow检测为4.5质粒拷贝/μl（约0.8寄生虫/μl），灵敏度极高。然而，当目标物种浓度超过10³质粒拷贝/μl（大约200寄生虫/μl）时，交叉反应变得明显，即单一物种高载量的样本会在另一物种检测通道产生阳性信号。

为了解决这一关键难题，研究者进一步制备了Poc和Pow质粒的模拟混合样本，涵盖低浓度范围（10²至10⁻¹拷贝/μl）以及不同比例（1:1，1:2，1:5，1:10），每种条件均重复运行10次qPCR。通过分析不同浓度和比例下的Ct值表现，团队制定了一套混合感染判定算法（图2）。该算法的核心思想是：当两个检测通道Ct值均小于49（阳性阈值）时，若优势物种的Ct值极低（<39），则弱势物种若Ct>44可能为交叉反应导致的假阳性，需综合判断；而当两个物种Ct值相对均衡或弱势物种Ct值较高但仍处于特定区间时，则可准确判定为混合感染。该算法保证了100%的诊断特异性，并维持了对微量物种的高灵敏度（Poc低至10⁻¹拷贝/μl，Pow低至10²拷贝/μl）。

1. 临床血液样本与蚊虫样本的应用
   验证对象包括两组现场样本：第一组是来自喀麦隆（16份）和坦桑尼亚（22份）、先前经pan-ovale qPCR鉴定为卵形疟原虫阳性的临床血液样本，样本形式包括干血斑（dried blood spots）和去白细胞血（leukodepleted blood）。第二组是源自坦桑尼亚的17份按蚊中肠（midgut）样本。这些中肠取自经膜饲血法（membrane feeding assays）或皮肤直接饲血法（direct skin feeding）喂养卵形疟原虫携带者血液的冈比亚按蚊（Anopheles gambiae），并在饲血后第8天解剖确认动合子（oocyst）阳性后，经DNazol法提取DNA。由于中肠DNA中疟原虫密度可能极低，研究者先采用疟原虫属级通用引物进行第一轮常规PCR扩增，随后对1:50稀释的产物进行第二轮Poc/Pow特异性qPCR检测。同时，对相应蚊虫吸血时的供血者血液样本也进行了qPCR物种鉴定。

三、主要研究结果

1. 方法分析性能与算法验证
   改良qPCR对单纯感染的检测限达到了亚寄生虫/μl水平，足以满足临床和蚊虫样本的检测需求。模拟混合样本实验显示，在1:1、1:2和1:5的物种比例下，次要物种的检出率保持良好；但当比例扩大到1:10时，Pow作为次要物种的检测灵敏度出现明显下降。最终确立的混合感染判定算法通过排除高浓度优势物种造成的交叉反应，在保持完美特异性的同时，实现了对Poc 84%和对Pow 94%的混合感染检测灵敏度。

2. 人体血液样本检测结果
   在37份卵形疟阳性血样中，改良qPCR的成功扩增率为70%（26/37），而未经优化的巢式PCR初始扩增率仅为35%（13/37）。经增加循环数和模板量后，巢式PCR的成功率提升至85%（23/27）。在19份同时被两种方法成功扩增的样本中，对主要优势物种的鉴定结果完全一致（100%）。更重要的是，qPCR额外发现了2例混合感染，而这2例在巢式PCR中仅检出单一物种。综合所有成功进行物种鉴定的28份血样，Poc单一感染占54%（15/28），Pow单一感染占36%（10/28），混合感染占11%（3/28）。这一结果初步证实了混合感染并非如文献所述那般稀少。

3. 蚊虫中肠样本的惊人发现
   蚊媒异种诊断（xenodiagnosis）结果则揭示了更为惊人的现象。在17份动合子阳性的蚊中肠DNA中，14份（82%）成功扩增，其中竟有11份（79%）被判定为Poc/Pow混合感染。对应到9名供血的卵形疟携带者，仅有2人在抽取的外周血中同时检测到两种疟原虫，但蚊虫中肠检测显示，除一人外，其余8人（89%）均将两种卵形疟原虫同时传播给了蚊子。也就是说，绝大多数携带者尽管血中只检出单一物种，其蚊媒传播阶却段实现了两种疟原虫的共同传播。

4. 检测结果的逻辑关联
   血液样本中相对偏低的混合感染检出率（11%）与蚊虫中肠中极高的混合感染率（79%）形成鲜明对比。这一方面表明，蚊虫作为天然的“生物采样器”，在吸血过程中可以从供血者体内有效富集那些密度极低、常规qPCR无法检出的亚微观配子体（gametocyte），从而暴露出血液中隐匿的混合感染；另一方面也说明，Poc和Pow在同一宿主内共同存在、共同传播的现象很可能是一种常态，而非偶然事件。

四、结论与研究价值

该研究成功构建了一套基于18S rRNA基因的改良real-time PCR工作流程及混合感染判定算法，为准确鉴定Poc和Pow单一及混合感染提供了可靠工具。应用该方法充分证明，库氏卵形疟原虫和沃氏卵形疟原虫在同一人类宿主及同一蚊媒中肠内的混合感染远比既往认知更为常见，尤其通过蚊虫异种诊断可获得前所未有的检出率，提示两种卵形疟原虫的同域传播和共同感染可能具有深远的流行病学意义。研究也指出，尽管两者不发生遗传重组，但频繁的共传播为它们在蚊群体内的基因交流创造了条件，物种屏障的维持机制值得进一步探究。

从应用价值来看，该研究揭示现有常规血液检测可能严重低估了卵形疟原虫混合感染的负担，这对疟疾消除策略的制定、物种特异性干预措施的评估均具有直接影响。科学价值方面，该工作不仅优化了疟原虫分子鉴定技术，还开辟了利用蚊媒样本对隐匿性混合感染进行分子监测的新视角，推动了对卵形疟原虫生物学和流行病学的再认识。

五、研究亮点

本研究的突出亮点可归纳为以下三个方面：第一，方法学创新。通过细致的交叉反应分析和混合样本模拟，建立了专门的判定算法，巧妙地克服了因两个物种18S rRNA序列高度相似所导致的交叉反应难题，实现了在单重反应中准确检测混合感染。第二，重要的生物学发现。在蚊中肠样本中首次报告了高达79%的Poc/Pow混合感染率，并证实在89%的携带者中发生了两种疟原虫的共同传播，颠覆了该领域长期以来认为混合感染罕见的观点。第三，揭示了异种