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Mark J. G. Bakkers等来自Janssen Vaccines & Prevention B.V.的研究团队于2024年在《Nature Communications》上发表了一项关于人类偏肺病毒（HMPV）疫苗的研究。

该研究属于病毒学和免疫学领域，旨在开发一种有效的HMPV疫苗。HMPV是一种包膜负义RNA病毒，可引起婴幼儿、老年人及免疫功能低下者的上下呼吸道感染。融合蛋白F是HMPV表面的关键蛋白，在病毒感染过程中发挥重要作用。为了诱导最有效的中和抗体，需要稳定其融合前构象（pre-fusion conformation）。然而，由于HMPV F蛋白的特殊结构特征，如较长的融合肽和F2 C末端区域，使其难以形成稳定的三聚体结构。

研究包括多个步骤：首先，研究人员分析了HMPV F蛋白的加工过程。通过Western blot和质谱分析，发现HMPV F蛋白在完全分化的支气管上皮细胞中被切割并截短。其次，设计了一系列重组HMPV F蛋白变体，包括引入R102Q突变以阻止切割、引入RSRR或REKR序列作为额外的切割位点，并优化HR2区域以增强三聚化。第三，使用AI卷积分类器（Recap模型）预测稳定pre-fusion构象的氨基酸替换。第四，通过多种实验方法评估这些变体的表达水平、稳定性及免疫原性。最后，利用冷冻电镜技术解析了双切割稳定pre-fusion HMPV F三聚体的结构。

具体实验流程如下： 1. 蛋白质工程与表达：合成编码C端标记F蛋白的DNA片段，并克隆到pCDNA2004表达载体中。将构建好的质粒转染Expi293F细胞，收集培养上清液进行后续分析。 2. 纯化与表征：采用两步纯化方案，先用C-tag亲和层析柱捕获目标蛋白，再用尺寸排阻色谱（SEC）进一步纯化。通过SDS-PAGE、SEC-MALS、差示扫描荧光法（DSF）等方法评估蛋白质的纯度、分子量和热稳定性。 3. 免疫原性测试：使用生物层干涉测量法（BLI）评估不同单克隆抗体对变体蛋白的结合能力。在小鼠和棉鼠模型中测试候选疫苗的免疫原性和保护效力。 4. 结构解析：利用单颗粒冷冻电镜技术解析双切割pre-fusion HMPV F三聚体的结构，分辨率达到3.1 Å。

主要结果包括： 1. 发现HMPV F蛋白在完全分化的支气管上皮细胞中被切割并截短，但未检测到明显的第二切割位点。 2. 引入RSRR或REKR序列作为额外的切割位点，可以实现HMPV F蛋白的完全双切割。优化HR2区域显著提高了三聚体的形成效率。 3. Recap模型成功预测了多个稳定pre-fusion构象的关键突变，如V112R和D209E。这些突变显著提高了蛋白质的表达水平和稳定性。 4. 冷冻电镜结构显示，双切割pre-fusion HMPV F三聚体具有完整的三级结构，包括茎部区域。新鉴定的C末端与相邻原聚体之间存在特异性相互作用。 5. 在小鼠和棉鼠模型中，双切割稳定pre-fusion HMPV F三聚体诱导了高水平的中和抗体反应，提供了接近完全的HMPV挑战保护。

该研究得出结论：通过AI指导的蛋白质工程，成功设计了一种双切割稳定pre-fusion HMPV F三聚体疫苗候选物。这种候选物无需异源三聚化域即可实现高表达产量和热稳定性，在动物模型中表现出优异的免疫原性和保护效力。

这项研究的意义在于提供了一种新的HMPV疫苗开发策略，具有重要的科学价值和应用前景。通过AI辅助设计，成功解决了HMPV F蛋白三聚化和稳定性的难题，为其他病毒疫苗的开发提供了借鉴。

研究亮点包括： 1. 首次报道了双切割稳定pre-fusion HMPV F三聚体的完整结构，包括茎部区域。 2. 开发了Recap模型，成功预测了多个关键稳定突变，显著提高了蛋白质的表达水平和稳定性。 3. 设计的候选疫苗在动物模型中表现出优异的免疫原性和保护效力，为HMPV疫苗的临床开发奠定了基础。

此外，该研究还展示了AI技术在蛋白质工程中的强大潜力，特别是在最小化修改的情况下显著改变蛋白质表达和增强三聚体稳定性方面。这种方法为导航复杂的蛋白质功能景观提供了简单而有效的AI驱动策略。