本研究由Luping Zhang、Dengyuan Zhou、Qiuyan Li等来自华中农业大学农业微生物学国家重点实验室、动物病毒学实验室及湖北省生物农药工程研究中心的研究人员共同完成，通讯作者为Shaoyong Ke和Jing Ye。该研究发表于Frontiers in Microbiology期刊，于2021年10月6日正式刊出，DOI为10.3389/fmicb.2021.727236。

黄病毒（flavivirus）是全球范围内最重要的节肢动物传播病原体之一，包括日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）、寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）、登革病毒（dengue virus, DENV）、西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）、蜱传脑炎病毒（tick-borne encephalitis virus, TBEV）和黄热病毒（yellow fever virus, YFV）等，可导致人类和动物的严重疾病，如脑炎、神经系统损伤、血管渗漏和出血性疾病等。尽管已有多种疫苗在一定程度上降低了黄病毒感染的发病率和死亡率，但全球范围内黄病毒疫情仍频繁暴发，目前尚无特异性商业化的抗黄病毒药物。因此，寻找和开发新型广谱抗黄病毒药物具有迫切需求。脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone, DHEA）是一种性类固醇前体，已有研究表明DHEA及其相关激素对JEV、流感病毒、单纯疱疹病毒、水泡性口炎病毒、人类免疫缺陷病毒和胡宁病毒等具有抗病毒活性。基于DHEA骨架进行结构改造，引入二腙活性单元，有望增强其与病毒靶点的相互作用并提高抗病毒效力。本研究旨在合成并筛选一系列新型甾体衍生物，系统评价其对JEV、ZIKV和DENV-2的抗病毒活性，并在体内模型中验证候选化合物的治疗效果。

研究首先以DHEA为母核，通过药效团杂合策略合成了23个甾体衍生物（编号AV1001至AV1024，其中AV1024为DHEA本身），并在BHK-21细胞中利用病毒诱导的细胞病变效应抑制实验进行初筛。结果显示，10个衍生物对JEV的抑制率超过90%，而DHEA本身的抑制率仅为50%。其中AV1003（4-氟苯基取代）、AV1004（4-氯苯基取代）和AV1017（吲哚-3-基取代）表现出最强的抗病毒效果，被选为后续研究的候选化合物。在Vero细胞中，通过基于发光的细胞活力检测法测定三种化合物的50%细胞毒性浓度（CC50）分别为383.1 μM（AV1003）、51.64 μM（AV1004）和51.30 μM（AV1017），最高无毒浓度均确定为20 μM。

在体外抗JEV实验中，研究者通过空斑实验、蛋白质印迹、免疫荧光和实时定量PCR等多种方法系统验证了三种衍生物的抗病毒作用。空斑实验和蛋白质印迹结果显示，AV1003、AV1004和AV1017以剂量依赖性方式抑制JEV增殖，其50%抑制浓度（IC50）分别为2.537 μM、2.537 μM和1.458 μM。选择性指数（SI）分别为大于151、大于20.35和大于35.19。在最高无毒浓度下，三种化合物对感染复数（MOI）高达10的JEV感染仍具有强抑制作用，且在感染后24、36和48小时均能降低感染性病毒颗粒的产生超过2个对数级。免疫荧光分析进一步证实三种化合物显著抑制JEV E蛋白的表达。为验证抗病毒作用是否具有细胞类型依赖性，研究者还在HeLa、BHK-21和SH-SY5Y细胞中检测了化合物的抑制效果，结果显示三种衍生物在不同细胞系中均以剂量依赖性方式抑制JEV增殖，表明其抗病毒作用不依赖于特定细胞类型。

在广谱抗黄病毒活性评价中，AV1003、AV1004和AV1017对ZIKV和DENV同样表现出显著的抑制作用。在Vero细胞中，三种化合物均以剂量依赖方式降低ZIKV和DENV的病毒滴度，其中AV1017对ZIKV的抑制最为显著，AV1004对DENV的抑制最为显著。时间进程实验显示，衍生物在感染后12小时即表现出抗病毒效果，且对DENV感染早期的抑制更为明显。

为明确化合物的作用阶段，研究者进行了加药时间实验。结果显示，三种化合物在病毒感染后（post-infection）加药时抗病毒效果最为显著，表明其主要作用于病毒入侵后的阶段。进一步的吸附实验和内化实验发现，AV1003和AV1004不干扰病毒的细胞吸附和内化过程，而AV1017则同时影响病毒的吸附和入侵阶段。通过JEV复制子（replicon）实验，研究者发现三种衍生物不能抑制JEV基因组复制，转染后24小时的荧光素酶信号和mRNA水平与对照组无显著差异。在环己酰亚胺（cycloheximide, CHX）存在下，化合物处理组中JEV RNA水平和荧光素酶信号仍低于DMSO对照组，进一步证明三种化合物作用于病毒入侵后、基因组翻译之前的阶段。

在体内实验中，AV1004因其在体外对JEV、ZIKV和DENV均具有良好的抑制效果而被选为候选治疗药物进行评价。C57BL/6小鼠通过腹腔注射感染JEV P3株（10^5 PFU），随后以35 mg/kg体重的剂量口服AV1004或DMSO，连续给药23天。结果显示，DMSO处理组小鼠在感染后第6天开始出现死亡，第13天死亡率达到90%；而AV1004治疗组小鼠的存活率为40%，并持续至整个23天观察期。临床行为学评分也显示AV1004治疗组小鼠的症状较DMSO组显著改善。在感染后第5天，AV1004治疗组小鼠脑组织中的病毒滴度显著低于DMSO组；第23天存活小鼠脑组织中未检测到病毒。组织病理学检查显示，JEV感染小鼠出现血管周围袖套和脑膜炎等脑炎表现，而AV1004治疗可减轻这些病理变化。免疫组织化学染色显示，AV1004降低了感染小鼠脑内小胶质细胞标志物Iba-1和星形胶质细胞标志物GFAP的阳性细胞数量，表明其可减少反应性胶质增生。实时定量PCR检测显示，AV1004治疗组小鼠脑组织中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、CCL2和CCL5的mRNA水平均显著降低。

本研究的主要创新点在于：首次基于DHEA骨架合成了23个含二腙活性单元的甾体衍生物，并系统评价了其抗黄病毒活性；明确了AV1003、AV1004和AV1017三种候选化合物的体外抗病毒谱及作用阶段；首次在体内模型中证实AV1004对JEV感染具有治疗潜力，可提高存活率、降低脑内病毒载量并减轻神经炎症反应。研究结果表明，DHEA衍生物可作为抗黄病毒药物研发的先导化合物骨架，AV1004尤其具有作为JEV感染治疗药物的开发前景。该研究为黄病毒感染的药物干预提供了新的分子框架和实验依据，也为基于天然产物骨架进行抗病毒药物设计提供了可借鉴的策略。