一项关于高效、脾脏选择性mRNA递送的新型咪唑基可电离脂质库的高通量筛选与鉴定的研究

一、 研究团队与发表信息

本项研究由中国科学技术大学第一附属医院放射科、生命科学与医学部以及中国科学院合肥物质科学研究院健康与医学研究所等机构的科研团队完成。主要作者包括王东、李智斌、侯太林、沈艳琼、郭子轩、苏毅坦、陈梓骐、潘慧敏等，通讯作者为姜伟教授和王育才教授。该项原创性研究成果于2024年5月22日在线发表于化学领域国际顶级期刊《Journal of the American Chemical Society》（J. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 15085–15095）。

二、 研究的学术背景

本研究聚焦于生物医学与纳米药物递送领域的前沿——信使核糖核酸（mRNA）治疗。mRNA疗法在预防性疫苗、治疗性疫苗、蛋白质替代疗法、癌症免疫治疗乃至基因编辑等方面展现出革命性的临床潜力。然而，mRNA分子本身具有大分子量和多聚阴离子特性，以“裸露”形式给药时易被快速降解且在体内分布受限，因此，高效、安全的递送系统是其临床转化的关键。

脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）是目前最成功的mRNA递送载体之一，已在临床上得到验证。尽管如此，如何实现mRNA向特定器官或组织的高效、选择性递送仍是一个重大挑战。脾脏作为人体最大的次级淋巴器官，在启动和调控适应性免疫应答中扮演着核心角色。针对脾脏的靶向递送，有望增强抗肿瘤免疫反应、促进对自身抗原或外源蛋白的耐受以治疗自身免疫及过敏性疾病，并减轻病理性炎症。因此，开发能够高效、选择性将mRNA递送至脾脏的LNP系统具有重要的科学意义和应用价值。

然而，目前大多数递送策略往往只关注脾脏转染强度（Intensity of Splenic Transfection, IST，即绝对蛋白表达水平），或仅提高脾脏转染比例（Proportion of Splenic Transfection, PST，即脾脏表达量占总表达量的百分比），难以同时实现高IST和高PST。此外，传统的体外筛选方法难以准确预测脂质在复杂生理环境中的体内递送性能。基于此，本研究旨在开发一种新型的、具有脾脏选择性的高效mRNA递送系统，并通过构建多维组合脂质库结合体内高通量筛选的策略，快速鉴定出最优的脂质候选分子，同时阐明其结构-活性关系，以指导未来脾脏选择性mRNA递送系统的理性设计。

三、 详细研究流程

本研究工作流程系统且高效，主要包含以下几个核心步骤：

1. 多维咪唑基可电离脂质（Imidazole-containing Ionizable Lipids, ImiLs）库的设计与合成：研究团队采用一锅法三组分Van Leusen反应（Van Leusen-3CR）作为核心合成策略。该反应条件温和，无需无水无氧环境，能够高效地将胺类（头部）、醛类（尾部）和芳基取代的甲苯磺酰甲基异腈（连接子）三种组分一步偶联，生成结构多样的咪唑基可电离脂质。通过系统性地组合不同的头部、尾部和连接子模块，研究团队成功构建了一个包含792种ImiL分子的多维组合库。这些模块的多样性体现在：胺头部的烷基链长度（8至18个碳）、饱和程度、是否含有可降解酯键、头部与咪唑环之间的碳间隔（2或3个碳）以及头部是否含有羟基、饱和环或芳香环等；醛尾部的烷基链长度、饱和度、是否含有酯键及苯环；连接子的芳香环结构差异。最终，通过制备薄层色谱纯化，成功合成了761种ImiL，为后续筛选提供了丰富的化学空间。

2. 正交批量体内高通量筛选策略的实施：为了避免体外筛选的局限性，研究团队开发了一套创新的体内正交批量筛选方法，旨在以最少的动物使用量、时间和成本，从庞大的脂质库中快速鉴定出最优候选分子。该策略分为三个批次进行：

   • 第一批次：胺头部筛选。将所有ImiL根据其胺头部结构分为9组，每组包含88种具有相同头部但不同尾部和连接子的ImiL。将这些ImiL分别制备成装载荧光素酶mRNA（mFLuc）的LNP（固定摩尔比：ImiL : DSPC : 胆固醇 : PEG-DMG = 50:10:38.5:1.5），然后将每组内的88种LNP混合，通过尾静脉注射给予小鼠。6小时后，通过活体成像系统（IVIS）检测各器官的生物发光信号，定量分析IST和PST，筛选出表现最佳的胺头部（A1和A3）。
   • 第二批次：醛尾部筛选。将所有ImiL根据其醛尾部结构分为11组，每组包含72种具有相同尾部但不同头部和连接子的ImiL。采用与第一批次相同的方法制备混合LNP并注射入小鼠体内，通过体内成像筛选出在脾脏转染中表现最佳的醛尾部（B5和B7）。
   • 第三批次：连接子筛选以确定最优ImiL。基于前两轮的筛选结果，将最优的头部（A1和A3）与最优的尾部（B5和B7）分别与8种不同的连接子配对，得到32种最具潜力的ImiL。这一次，研究团队不再混合LNP，而是将每种ImiL单独制备成LNP并分别注射到不同的实验组小鼠中（每组n=3），以更精确地评估其性能。同样通过体内成像分析IST和PST，最终鉴定出两个性能最优的ImiL：A1B7C2和A3B7C2。

3. 最优ImiL的性能验证与比较分析：确定了A3B7C2为顶级候选分子后，研究团队对其进行了深入的性能评估和比较。

   • LNP制备与表征：使用微流控装置制备了基于A3B7C2和A1B7C2的四组分LNP（不含阴离子脂质）。同时，制备了已获FDA批准的临床用脂质（DLin-MC3-DMA，简称MC3和SM102）的LNP，以及文献报道的脾脏靶向SORT（Selective Organ Targeting）五组分LNP（包含阴离子脂质18:PA）作为对照。对所有LNP的粒径、多分散指数（PDI）、Zeta电位和包封效率进行了表征。
   • 体内转染效率比较：在小鼠模型中，以低剂量（0.1 mg/kg）的mFLuc静脉注射上述五种LNP。6小时后通过活体成像定量比较它们在脾脏和其他器官中的表达。结果表明，基于A3B7C2的LNP在脾脏中实现了最高的IST（4.4 × 10^7 p/s/cm²/sr）和近乎完美的PST（98%），其脾脏转染强度分别是SM102和MC3 LNP的2.8倍和12.9倍，并且相较于SORT LNP（需要额外添加阴离子脂质）也提高了18.3倍。
   • 体内安全性评估：通过血液生化指标（ALT， AST，尿素，肌酐）和组织病理学（H&E染色）分析，评估了LNP的体内毒性。结果显示，A3B7C2 LNP与PBS对照组相比未引起明显的肝肾功能损伤或组织病理学变化，而SORT LNP在给药后12小时引起了轻微的肝损伤，提示A3B7C2 LNP在安全性上可能更具优势。

4. 脾脏树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）转染效率评估：为了探究A3B7C2 LNP在脾脏内的具体细胞靶向性，研究团队利用Ai9报告基因小鼠模型进行了深入分析。该模型在LoxP-stop-LoxP位点后带有tdTomato红色荧光蛋白报告基因。研究人员将编码Cre重组酶的mRNA（mCre）装载到不同的LNP中，静脉注射给Ai9小鼠。Cre蛋白的表达会切除stop序列，从而激活tdTomato的表达。4天后，取脾脏和肝脏进行冰冻切片和免疫荧光染色（标记DC标志物CD11c），通过共聚焦显微镜观察和流式细胞术分析，评估不同LNP对脾脏DCs的转染效率。结果显示，A3B7C2 LNP能够在脾脏红髓区域（DCs主要分布区）高效地转染DCs，其tdTomato与CD11c的共定位程度和平均荧光强度均显著高于其他LNP对照组，证明了其对脾脏DCs的高效且选择性转染能力。

四、 主要研究结果

研究流程中的每一步都产生了关键数据，并逻辑严密地导向了最终结论。

在库构建与筛选阶段，高通量体内筛选结果清晰显示：胺头部的结构，特别是咪唑环与氨基之间的碳间隔长度，对脾脏转染效率（IST）有显著影响，2个碳的间隔（如A1， A3）优于3个碳的间隔（A2， A4）。醛尾部的结构也至关重要，含有酯键和苯环的长链（18碳）尾部B7能够实现超过95%的PST；尾部碳链长度在无酯键的情况下存在一个最优范围（8-14碳）。最终，通过连接子筛选，从32个候选分子中鉴定出A3B7C2，其基于LNP在0.5 mg/kg剂量下实现了高达1.374 × 10^8 p/s/cm²/sr的IST和超过97%的PST。这些结果不仅验证了筛选策略的有效性，也初步揭示了ImiL分子结构（头部间隔、尾部酯键与链长）与脾脏靶向递送性能之间的构效关系。

在性能验证与比较阶段，关键的对比实验数据有力地支持了A3B7C2的优越性。与临床脂质MC3和SM102相比，A3B7C2 LNP将mRNA递送的主要器官从肝脏成功转向了脾脏，PST从极低的3.4%和11.3%大幅提升至98%，同时脾脏的绝对表达强度（IST）也显著超越。与需要额外添加阴离子脂质的脾靶向SORT方法相比，A3B7C2仅用四组分LNP就实现了更高的IST（18.3倍提升）和相当的PST（90% vs 98%），且在安全性评估中未观察到SORT LNP可能引起的短暂肝损伤。这些结果共同证明，A3B7C2 LNP无需借助靶向配体或复杂的五组分配方，即可实现高效、高选择性的脾脏mRNA递送，且在低剂量下表现卓越。

在细胞水平机制探索阶段，Ai9小鼠模型的实验结果将靶向性从器官层面精确到了细胞层面。免疫荧光和流式分析证实，A3B7C2 LNP能够高效地将功能性mCre递送至脾脏的DCs并使其成功表达Cre蛋白，导致报告基因激活。这种对DCs的高效转染，与其在脾脏红髓区域的富集信号相吻合，揭示了其潜在的细胞作用位点。这一发现具有重要的应用价值，因为DCs是连接先天免疫与适应性免疫的关键抗原呈递细胞，高效转染脾脏DCs为开发基于mRNA的脾脏原位DC编程免疫疗法提供了理想的工具。

五、 研究结论与价值

本项研究成功开发并筛选出一种名为A3B7C2的新型咪唑基可电离脂质。基于该脂质制备的四组分LNP，能够在无需额外靶向配体或阴离子脂质辅助的情况下，实现mRNA的高效、高选择性脾脏递送。其脾脏转染比例高达98%，转染强度显著优于现有临床脂质及脾靶向SORT方法，并能特异性高效转染脾脏树突状细胞。

本研究具有多重价值： 1. 科学价值：通过构建多维ImiL库和创新的体内正交批量筛选策略，系统性地探索了脂质分子结构（头部、尾部、连接子）与脾脏靶向mRNA递送性能之间的构效关系。研究指出，胺头部的羟基化、尾部酯键的存在以及连接子的芳香环结构是影响脾脏靶向效率的关键因素，为未来理性设计器官选择性递送载体提供了宝贵的分子设计见解。 2. 方法学价值：开发的高通量、多维体内筛选流程，极大地降低了从大型脂质库中筛选最优候选分子所需的动物数量、时间和成本，为其他核酸递送系统或药物载体的快速发现与优化提供了一种高效的研究范式。 3. 应用价值：A3B7C2 LNP作为一种高效、脾脏选择性的mRNA递送平台，为脾脏相关疾病的mRNA治疗（如增强抗肿瘤免疫、诱导抗原特异性耐受治疗自身免疫性疾病、开发脾脏靶向疫苗等）提供了强大的工具。特别是其高效转染脾脏DCs的能力，为开发下一代基于mRNA的免疫疗法铺平了道路。

六、 研究亮点

1. 创新性的脂质分子设计：首次报道了基于Van Leusen反应构建的咪唑基可电离脂质库，将咪唑基团引入可电离脂质设计中，并结合多维组合化学，快速生成大量结构多样的候选分子。
2. 高效的体内高通量筛选策略：突破了传统体外筛选的局限，首创了正交分批次混合注射的体内筛选方法，极大地提高了筛选通量和效率，是技术上的重要创新。
3. 卓越的递送性能：筛选出的A3B7C2 LNP同时实现了极高的脾脏转染强度（IST）和转染比例（PST），在低剂量下性能超越现有标杆体系，且配方简单（四组分），安全性良好。
4. 明确的细胞靶向性：研究不仅停留在器官靶向层面，更进一步证实了该LNP对脾脏内关键的免疫细胞——树突状细胞（DCs）的高效转染能力，明确了其潜在的作用细胞类型，提升了其应用针对性。
5. 系统的构效关系分析：研究过程本身即是一次系统的构效关系探索，明确了影响ImiL脾脏靶向性能的关键结构因素，对领域内的分子设计具有指导意义。

七、 其他有价值的内容

研究中对LNP的表征数据（如粒径、PDI、Zeta电位、pKa等）以及详细的合成与表征信息（见支持信息），为同行复现和深入理解该工作提供了充分依据。此外，文章还系统梳理并对比了此前文献中报道的各种脾脏靶向递送策略的载体类型、剂量、IST和PST（见附表S3），在学术讨论中展现了充分的广度和深度，进一步凸显了本研究成果的先进性和竞争力。