本研究由Simeng Yi、Min Huang、Chunmei Xian等来自西南医科大学附属医院神经系统疾病与脑功能实验室（Laboratory of Neurological Diseases and Brain Function, The Affiliated Hospital, Southwest Medical University）、西南医科大学表观遗传学与脑科学研究所（Institute of Epigenetics and Brain Science, Southwest Medical University）的多位研究者共同完成，于2025年6月9日发表在学术期刊《Theranostics》（2025年第15卷第14期，页码7001-7024）。

学术背景

胎儿缺氧是导致新生儿死亡和永久性脑损伤的主要因素，约23%的受影响新生儿会出现不可逆的神经功能缺陷，包括认知障碍、抑郁和焦虑等远期行为异常。传统动物模型因物种差异和行为变异性存在局限，而现有的三维（3D）人脑类器官（brain organoids）模型缺乏血管系统和免疫组分（如小胶质细胞），难以模拟神经血管互作和炎症反应。为此，本研究开发了一种血管化人脑皮质类器官（vascularized human cortical organoids, VHCOs）模型，整合了皮质类器官（HCOs）与血管类器官（HBVOs），旨在单细胞分辨率下解析缺氧-复氧损伤中细胞类型特异性应激适应机制。

研究流程

1. 模型构建

   • HCOs制备：使用H9人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）通过悬浮培养生成胚胎体（embryoid bodies, EBs），分阶段诱导为皮质类器官（HCOs），历时75天，直径从419.15±14.40 µm增至1556.85±118.98 µm。免疫染色验证了神经前体细胞（SOX2、PAX6）、中间祖细胞（TBR2）、皮质层神经元（TBR1）和成熟星形胶质细胞（GFAP+）的存在。
     
   • HBVOs制备：通过EBs分阶段诱导为血管类器官（HBVOs），10天后形成直径894.42±65.93 µm的球体，包含CD31+内皮细胞（endothelial cells, ECs）、PDGFRβ+周细胞（pericytes）和ACTA2+平滑肌细胞（smooth muscle cells, SMCs）。
     
   • VHCOs融合：将30天的HCOs与10天的HBVOs共培养30天，形成直径1863.22±134.14 µm的整合类器官。免疫荧光显示其具备血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）特征：ZO-1/CLDN5+紧密连接、GFAP+/S100B+星形胶质细胞与血管共定位。
     

2. 缺氧-复氧模型

   • 60天的VHCOs暴露于1%低氧环境48小时（模拟急性缺氧），随后复氧5天（21% O₂）。免疫组化和qPCR证实缺氧诱导因子HIF-1α及缺氧响应基因（如AK4、PDK1）显著上调。
     

3. 单细胞转录组分析

   • 对缺氧、复氧及对照组VHCOs进行单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），共分析46,418个细胞，鉴定出16种细胞类型，包括神经前体细胞（ventricular radial glia, vRG；outer radial glia, oRG）、中间祖细胞（intermediate progenitors, IPs）、星形胶质前体细胞（astrocyte precursors, AstPs）、GABA能神经元（GABAergic neurons）、谷氨酸能神经元（glutamatergic neurons）、少突胶质细胞（oligodendrocytes）、小胶质细胞（microglia）、内皮细胞（ECs）、周细胞、平滑肌细胞、间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells, MSCs）和成纤维细胞（fibroblasts）。
     

4. 关键发现

   • 细胞类型特异性损伤：
     
     • AstPs表现为发育停滞（持续下调NFIA、ZBTB20等胶质发生基因）和突触功能受损（DST、FZD3下调）。
       
     • GABA能神经元亚型I（低GAD1/2表达）出现神经源性崩溃，而亚型II（高GAD1/2表达）表现出缺氧耐受性。
       
     • 小胶质细胞呈现双相炎症反应：缺氧期抑制（AXL、NF-κB下调），复氧期超活化（CCL3、IL6上调）。
       
   • 血管重塑：缺氧期ECs血管生成信号（EFNB2、MMP14）受抑，复氧期通过NOTCH信号（JAG1-NOTCH3）和胶原沉积（COL3A1、COL5A1）驱动修复。
     
   • 细胞互作重编程：
     
     • 神经-非神经互作网络（如IGF2-IGF2R、LGALS3-MERTK、WNTs-SFRP2）在修复期显著激活。
       
     • CellPhoneDB分析揭示缺氧后BBB破坏（GJA1-TJP1下调）及复氧期通过LGALS3-MERTK信号修复。
       

5. 调控机制

   • SCENIC分析显示：
     
     • AstPs中SOX2靶基因激活可能参与修复。
       
     • GABA能神经元亚型I中ATF4驱动的未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）与缺氧易感性相关。
       
     • 复氧期周细胞和MSCs中ARID3A/MSX1上调促进肌源性分化。
       

结论与价值

本研究通过VHCOs模型首次在单细胞层面揭示了人类胎儿脑缺氧-复氧损伤的细胞特异性机制：
1. 科学价值：填补了传统模型无法模拟神经血管单元（neurovascular unit）的空白，明确了AstPs和GABA能神经元亚型I为关键脆弱靶点，为精准干预提供新靶标（如IGF2-IGF2R通路）。
2. 应用价值：VHCOs可作为药物筛选平台，评估针对缺氧后神经保护或血管修复的疗法。

研究亮点

1. 创新模型：首个整合BBB和小胶质细胞的血管化类器官，模拟人类胎儿脑发育（8-16孕周转录特征）。
   
2. 技术突破：单细胞转录组结合SCENIC/CellPhoneDB多组学分析，解析缺氧记忆（hypoxia memory）在非神经细胞的持续效应。
   
3. 临床意义：发现小胶质细胞双相炎症和GABA能神经元亚型异质性，为新生儿脑病分层治疗提供依据。
   

局限与展望

1. 未功能验证BBB通透性，未来需微流控技术整合。
   
2. 仅使用H9细胞系，需多供体验证普适性。
   
3. 缺乏少突胶质细胞谱系，需优化培养方案。
   

此研究为理解人类特异性缺氧脑损伤机制树立了新范式，并为开发神经保护策略奠定了坚实基础。