学术研究报告：AAV-Perturb-Seq技术在22q11.2缺失综合征研究中的应用
作者与发表信息
本研究由Antonio J. Santinha（瑞士苏黎世联邦理工学院生物系统科学与工程系）、Esther Klingler（瑞士日内瓦大学基础神经科学系）等合作团队完成，发表于Nature期刊（2023年8月在线发表，DOI: 10.1038/s41586-023-06570-y）。
学术背景
科学领域：本研究属于功能基因组学和神经发育疾病的交叉领域，聚焦于22q11.2缺失综合征（22q11.2 deletion syndrome, 22q11.2DS）的分子机制。
研究动机：22q11.2DS是人类最常见的染色体微缺失疾病之一，与精神分裂症、自闭症谱系障碍（ASD）等神经发育疾病密切相关。然而，该综合征涉及的基因数量多（约37个基因），单个基因的功能及其协同作用机制尚不明确。传统方法（如体外CRISPR筛选或发育阶段研究）难以模拟体内复杂组织的表型。
目标：开发一种高通量、高分辨率的体内单细胞CRISPR筛选技术（AAV-Perturb-Seq），系统性解析22q11.2基因在成年小鼠前额叶皮层中的功能，并揭示其与疾病表型的因果关系。
研究流程与方法
1. AAV-Perturb-Seq技术开发
- 载体设计：构建重组腺相关病毒（AAV）载体，包含CRISPR guide RNA（gRNA）表达盒和转录组捕获元件（5’或3’端捕获设计）。
- 递送优化：使用AAV.PHP.B血清型（可全身递送），通过尾静脉注射至成年LSL-Cas9转基因小鼠（n=15），感染大脑广泛细胞类型。
- 单核RNA测序（snRNA-seq）：分离感染细胞核（约60,000个），通过10x Genomics平台进行单核转录组和gRNA共捕获。
- 数据分析流程：
- 细胞分群：Seurat算法聚类识别神经元（浅层/深层兴奋性神经元、中间神经元）和非神经元细胞（星形胶质细胞、少突胶质细胞等）。
- 表型关联：基于伪批量（pseudobulk）差异表达分析（EdgeR软件），鉴定gRNA特异性转录变化。
2. 22q11.2基因功能筛选
- 靶基因选择：基于DropViz数据库筛选29个在成年小鼠前额叶皮层表达的22q11.2同源基因。
- CRISPR文库：每个基因设计2条gRNA，共58条，另加5条对照gRNA（靶向安全港位点）。
- 实验验证：
- 基因编辑效率：深度测序验证Cas9诱导的插入/缺失突变（indels），平均编辑效率>50%。
- 单基因验证实验：通过阵列注射（arrayed injection）靶向关键基因（如DGCR8、DGCR14、GNB1L），使用神经元特异性启动子（hSyn）增强靶向性。
3. 表型分析与机制解析
- 差异表达基因（DEGs）：在神经元中鉴定到DGCR8、DGCR14、GNB1L和UFD1L的显著转录表型。
- DGCR8：上调miRNA初级转录本（如miR-9、miR-124a），导致RNA沉默通路紊乱。
- DGCR14：下调剪接体相关基因（如SRSF家族），影响RNA加工。
- GNB1L：下调突触信号基因（如GRIA1、NRXN1），破坏神经元通讯。
- 与疾病模型对比：比较LgDel小鼠（模拟22q11.2缺失）的转录组，发现上述3个基因的扰动可解释约40%的LgDel表型。
主要结果与逻辑关联
- 技术验证：AAV-Perturb-Seq成功实现体内单细胞水平的多基因扰动与转录组联分析，覆盖6种脑细胞类型。
- 关键基因功能：
- DGCR8通过miRNA加工调控神经元RNA稳态；
- DGCR14参与剪接体功能；
- GNB1L影响突触可塑性。
- 疾病关联：这些基因的失调与精神分裂症和ASD风险基因高度重叠（如GNB1L下调的44个基因中，22个与突触功能相关）。
结论与意义
科学价值：
- 首次建立直接体内单细胞CRISPR筛选平台，克服了传统方法在组织复杂性和发育时间点的限制。
- 阐明22q11.2DS中多个基因的成年期功能，挑战了“仅发育缺陷致病”的传统观点。
应用价值：为神经发育疾病的靶点发现和治疗策略（如基因干预）提供新思路。
研究亮点
- 方法创新：AAV-Perturb-Seq兼具可调性和广泛适用性，可扩展至其他组织或疾病模型。
- 发现新颖性：揭示DGCR14和GNB1L在成年神经元的未知功能，填补了22q11.2DS机制的空白。
- 转化潜力：鉴定DGCR8等关键基因的调控网络，为疾病治疗提供潜在靶点。
其他价值
研究还开发了计算流程（如线性判别分析LDA过滤非扰动细胞），提高了数据信噪比，为后续类似研究提供方法论参考。