本文由Julia F. Hyslop、Sarah L. Lovelock、Peter W. Sutton、Kristin K. Brown、Allan J. B. Watson和Gheorghe-Doru Roiban等作者共同完成，发表于《Angewandte Chemie》国际版（Angewandte Chemie International Edition），出版时间为2018年。该研究的主要机构包括英国斯特拉斯克莱德大学（University of Strathclyde）、葛兰素史克（GlaxoSmithKline）药物研究中心、曼彻斯特大学（University of Manchester）以及美国宾夕法尼亚州的葛兰素史克分子设计与计算科学部门等。

研究背景

手性非天然氨基酸（chiral non-natural amino acids）在制药和农用化学品行业中具有重要地位，尤其是在活性药物成分（APIs）和生物活性肽的合成中。这些氨基酸能够增强药物的生物利用度和代谢稳定性。然而，传统的化学合成方法通常依赖于有毒试剂和危险溶剂，且生成大量废弃物，因此开发可持续且高效的合成方法成为迫切需求。生物催化（biocatalysis）作为一种绿色替代方案，近年来受到广泛关注。尽管已有多种酶被用于氨基酸的合成，但针对N-功能化氨基酸（N-functionalized amino acids）的合成，尤其是手性N-烷基化氨基酸的合成，仍然面临挑战。

本研究旨在开发一种基于生物催化的不对称合成方法，通过还原偶联酮和胺来合成手性N-烷基化氨基酸。研究团队筛选了多种酶，包括N-甲基氨基酸脱氢酶（N-methylamino acid dehydrogenases, NMAADHs）、酮亚胺还原酶（ketimine reductases, KIREDs）和D1-吡咯啉-5-羧酸还原酶（D1-pyrroline-5-carboxylate reductases, P5CRs），以评估它们在N-功能化氨基酸合成中的应用潜力。

研究流程

研究分为以下几个主要步骤：

1. 酶的选择与表达：研究团队从不同物种中筛选了七种酶（EN01-EN07），分别属于NMAADHs、KIREDs和P5CRs三个不同的酶家族。这些酶在大肠杆菌（Escherichia coli）中过表达并纯化，用于后续的实验。

2. 底物筛选与反应优化：研究团队评估了这些酶对苯丙酮酸（phenylpyruvic acid, 1a）与多种胺（2a-g）的还原偶联反应活性。反应在优化的条件下进行（200 mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.5），并通过高效液相色谱（HPLC）分析反应产物。结果显示，不同类别的酶对不同的胺底物表现出互补的反应活性。例如，NMAADHs（EN01-EN03）对甲基胺（2a）表现出几乎完全的转化率，而KIREDs（EN04-EN06）对含有芳香族基团的胺（如2f）表现出较广的底物耐受性。

3. 克级规模合成：为了验证这些酶的实际应用价值，研究团队在克级规模上进行了反应。结果表明，EN01和EN04分别能够高效合成N-甲基苯丙氨酸（3a）和N-苄基苯丙氨酸（3f），且产物的光学纯度极高（ee > 99%）。

4. 分子对接研究：为了进一步理解反应的选择性机制，研究团队对EN01、EN05和EN07进行了分子对接研究。结果显示，底物与酶活性位点之间的氢键相互作用在反应选择性中起到了关键作用。

主要结果

1. 酶的反应活性：不同类别的酶对不同的胺底物表现出显著的反应活性差异。NMAADHs对甲基胺和丙炔胺（propargylamine）表现出较高的转化率，而KIREDs对含有芳香族基团的胺表现出较广的底物耐受性。P5CRs则对丙炔胺表现出偏好性。

2. 克级合成：在克级规模上，EN01和EN04分别成功合成了N-甲基苯丙氨酸和N-苄基苯丙氨酸，产率分别为80%和9%。尽管EN07的产率较低（21%），但其对丙炔胺的选择性仍然显著。

3. 分子机制：分子对接研究表明，底物与酶活性位点之间的氢键相互作用是反应选择性的关键因素。特别是，底物的羧酸基团与酶活性位点中的精氨酸残基之间的相互作用在反应中起到了重要作用。

结论

本研究首次报道了KIREDs和P5CRs在还原胺化反应中的应用，并展示了这些酶在N-功能化氨基酸合成中的互补性底物特异性。研究团队通过克级规模的生物转化验证了这些酶的合成实用性，尽管在大多数情况下需要过量的胺底物，但在某些情况下，使用等摩尔比的底物也能实现显著的转化率。未来的研究将集中于通过反应工程和实验室进化进一步优化这些酶的底物范围和稳定性，以开发工业上可行的合成工艺。

研究亮点

1. 新颖的酶应用：本研究首次报道了KIREDs和P5CRs在还原胺化反应中的应用，扩展了生物催化在N-功能化氨基酸合成中的应用范围。
2. 广泛的底物耐受性：筛选的酶对多种胺底物表现出广泛的耐受性，尤其是KIREDs对含有芳香族基团的胺表现出较高的反应活性。
3. 克级合成验证：研究团队在克级规模上验证了这些酶的合成实用性，展示了其在工业应用中的潜力。
4. 分子机制研究：通过分子对接研究，揭示了底物与酶活性位点之间的相互作用机制，为未来的酶工程提供了理论依据。

研究意义

本研究为手性N-功能化氨基酸的绿色合成提供了新的生物催化工具，具有重要的科学和应用价值。通过开发高效的生物催化工艺，可以减少传统化学合成中对有毒试剂和危险溶剂的依赖，降低环境污染，同时提高合成的选择性和产率。这一研究为制药和精细化工行业提供了可持续的合成路线，具有广泛的应用前景。