本研究由中国科学院武汉病毒研究所病毒学国家重点实验室的王薇研究员课题组主导完成，第一作者为郭娇（西安医学院基础医学部病原微生物与肿瘤免疫西安市重点实验室）。论文发表于 Virologica Sinica 第39卷第600–608页，2024年6月6日在线发表。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目的资助。
拉沙病毒（Lassa virus, LASV）属于沙粒病毒科（*Arenaviridae*）哺乳动物沙粒病毒属，是一种有包膜、负义、双节段RNA病毒，被归类为旧世界（Old World, OW）哺乳动物沙粒病毒。LASV通过其自然宿主——纳塔尔乳鼠（*Mastomys natalensis*）的排泄物传播给人类，引起拉沙出血热（Lassa hemorrhagic fever），住院患者病死率极高。然而，目前尚无经FDA批准的疫苗或特异性抗病毒药物。
LASV基因组编码RNA依赖性RNA聚合酶（L）、核蛋白（NP）、基质蛋白（Z）以及高度糖基化的膜糖蛋白（GP）。糖蛋白前体复合物（glycoprotein precursor complex, GPC）合成后裂解为三个亚基：稳定信号肽（stable signal peptide, SSP）、受体结合亚基GP1和膜融合亚基GP2。在细胞入侵过程中，LASV GP1首先与细胞膜上的初级受体α-肌营养不良聚糖（alpha-dystroglycan, α-DG）相互作用，病毒经巨胞饮作用内化后进入晚期内体区室。在低pH环境下，GP发生不可逆的构象变化，降低对α-DG的亲和力，同时增强对酸性受体——溶酶体相关膜蛋白1（lysosome-associated membrane protein 1, LAMP1）的亲和力，这一过程被称为“受体转换”（receptor switch）。此前研究发现，LASV GP1中一个高度保守的组氨酸三联体（histidine triad, H92/93/230）对LAMP1结合至关重要。然而，作者提出假设：除该保守三联体外，其他非保守残基是否也参与受体转换？
为验证这一假设，研究团队将LASV与遗传学和血清学上相似但不与LAMP1相互作用的原型旧世界沙粒病毒——淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV）进行比较，通过将LASV GP1中的若干非保守残基突变为LCMV对应残基，系统筛查参与LAMP1结合的氨基酸位点。
第一环节：候选残基的筛选与LAMP1结合能力的初步筛查。 研究团队对LASV GP1与LCMV GP1的氨基酸序列进行多重比对，筛选标准包括：（1）空间上位于LASV GP1与LAMP1的相互作用界面；（2）空间上邻近组氨酸三联体（H92/93/230）；（3）改变极性氨基酸性质的非保守残基。据此选定若干位点并逐一突变为LCMV对应残基，包括L84N、K88E、L107F、H170S以及E100S、T101S、K116N、H124L、K125N、Q232R等。利用LAMP1 pull-down实验（在pH 5.0条件下）检测突变体GP1-Fc与LAMP1的结合能力。结果显示，L84N、K88E、L107F和H170S四个突变显著破坏了GP1-Fc与LAMP1的结合，而其他突变体影响甚微。阳性对照H92Y、H93Y和H230Y均不结合LAMP1，与先前文献报道一致。
第二环节：GPC裂解效率的检测。 由于GPC裂解为GP1和GP2是膜融合的上游事件，裂解效率的降低将直接影响融合活性。研究者将野生型及四种突变型GPC表达质粒分别转染293T细胞，通过Western blotting检测GP2条带强度以量化裂解效率。结果发现，GPC-L107F和GPC-H170S的裂解效率与野生型相当，而GPC-L84N的裂解效率下降至约野生型的4%，GPC-K88E约为25%。
第三环节：GPC介导的膜融合功能检测。 采用双荧光素酶报告基因定量检测系统和荧光显微镜定性观察两种方法，在pH 4.5、5.0和5.2三个条件下评估各突变体的膜融合效率。结果显示GPC-L84N在所有测试pH下融合效率均低于20%；GPC-K88E的融合效率为野生型的42%–63%；GPC-L107F为46%–80%。值得注意的是，GPC-H170S在pH 5.0时融合效率约为野生型的两倍，但在pH 4.5和5.2时低于野生型，提示pH 5.0可能是H170S突变体介导膜融合的最适pH。
第四环节：假病毒感染力检测及LAMP1敲除细胞验证。 以水疱性口炎病毒（VSV）为骨架构建携带LASV GPC的假病毒（LASVpv），以海肾荧光素酶（Renilla luciferase）为报告基因。定量RT-PCR归一化病毒拷贝数后，分别感染A549、BHK、HEK293T和Vero细胞。结果显示，L84N和K88E突变假病毒在几乎所有细胞类型中的感染力均急剧下降（L84N在A549和BHK细胞中感染力降低约3.3个log值），而L107F和H170S对感染力的影响相对温和。为进一步确认这四个残基在LAMP1结合中的重要性，研究者利用CRISPR/Cas9技术构建了LAMP1敲除的A549细胞系，LAMP1回补实验证实敲除后假病毒感染力显著降低，而回补LAMP1则恢复感染力。更重要的是，四种突变假病毒在LAMP1敲除细胞中的感染力下降幅度均小于野生型，表明LAMP1敲除对突变病毒的影响较小，间接证明这四个残基对LAMP1结合的重要性。
第五环节：生物膜层干涉技术（Biolayer Interferometry, BLI）动力学检测。 利用Octet RED96仪器，将生物素化的LAMP1远端结构域蛋白（distal LAMP1, 残基27–194）固定于链霉亲和素包被的传感器上，检测不同浓度（200–1600 nmol/L）的GP1-Fc蛋白的结合响应值。结果显示，野生型及各突变型GP1-Fc均呈剂量依赖性结合，LCMV GP1-Fc则完全不结合。LAMP1结合亲和力排序为：L84N > L107F > K88E > H170S。H170S突变几乎完全消除LAMP1结合能力，与pull-down实验结果一致。
第六环节：IIH6抑制实验。 为确认四个突变是否影响GP1与细胞表面初级受体α-DG的结合，研究者使用单克隆抗体IIH6（特异性识别功能性糖基化的α-DG）预处理A549细胞后再进行假病毒感染。结果显示IIH6能显著阻断野生型及所有四种突变假病毒的转导，说明这些突变主要影响的是LAMP1结合而非α-DG结合。
本研究首次鉴定了LASV GP1中四个此前未被报道的、对受体转换至关重要的氨基酸残基：L84、K88、L107和H170。将它们分别替换为LCMV对应残基（L84N、K88E、L107F、H170S）后，均降低了GP1对LAMP1的结合亲和力，并抑制了GPC介导的膜融合和假病毒的感染力。
从结构角度看，基于GP1的晶体结构（PDB: 5VK2），K88位于组氨酸三联体的中心位置。K88E替换显著降低膜融合效率，提示带正电荷的K88残基可能在感知内溶酶体区室的酸性pH中发挥关键作用，从而促进受体转换和GP1构象变化。这一机制与稳定信号肽中位于膜近端区域的关键带电残基K33类似——已有研究报道K33的电荷改变型替换会影响GPC成熟及其下游功能，对GPC的pH敏感性至关重要。另一个带正电荷的残基H170位于GP1结构顶部，可能以类似K88和K33的方式参与pH感知。而L84和L107位于组氨酸三联体附近，可能对维持三联体结构及GP1-LAMP1相互作用界面的完整性起重要作用。
有趣的是，突变体T87S和V164I显著增强了GP1-Fc与LAMP1的结合，作者推测这些突变可能改变了GP1-Fc的结构或稳定性。此外，研究者还构建了LCMV GP1的对应反向突变体（N90L、V94K、F110L、S174H），但均未能获得与LAMP1的相互作用，说明这四个残基在LASV GP1中的影响大于在LCMV GP1中，单独的LCMV对应突变不足以赋予其LAMP1结合能力。
本研究首次鉴定出LASV GP1中四个参与受体转换的非保守氨基酸残基，在理论上深化了对LASV入侵机制中宿主-病原体相互作用的理解，特别是对组氨酸三联体以外的辅助残基在受体转换中的结构生物学意义提供了新的视角。在应用层面，这些位点为深入阐明LASV的受体转换机制、免疫逃逸机制以及开发抗LASV感染的储备药物和减毒疫苗提供了重要的参考靶点。此外，LAMP1敲除细胞中感染力并未被完全消除的结果提示LASV可能存在非LAMP1依赖的入侵途径，这为进一步探讨LASV感染的复杂性以及α-DG与LAMP1之间的关系指明了方向。
本研究的亮点在于：（1）首次系统性地通过LASV-LCMV序列比对策略，鉴定出四个新的、非保守的氨基酸残基参与LASV的受体转换过程；（2）综合运用pull-down、BLI动力学分析、假病毒感染力检测和CRISPR/Cas9基因敲除等多种互补的实验手段，从蛋白互作、膜融合和病毒感染三个层面交叉验证了突变体的功能缺陷；（3）提出了K88和H170作为潜在pH感应残基的工作模型，为后续结构生物学和生物物理学研究提供了可检验的假说。