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肥胖通过TGFβR过度激活驱动CD103⁺/ITGB2⁺组织驻留记忆T细胞积聚加剧胶原诱导性关节炎

一、研究作者与发表信息

本研究由Sijia Yan、Xu Wang和Xianting Ding等人共同完成，主要研究机构包括上海交通大学医学院附属瑞金医院病理科、上海交通大学医学院细胞分化与凋亡教育部重点实验室、上海交通大学转化医学研究院、上海交通大学医学院附属新华医院麻醉与外科重症监护科等。该研究发表于*International Journal of Biological Sciences*，2026年第22卷第8期，页码4095–4115。

二、研究背景与目的

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种以关节滑膜炎症、软骨侵蚀和骨破坏为主要病理特征的慢性自身免疫性疾病。肥胖已被大量流行病学研究证实是RA发病和不良预后的独立危险因素：肥胖患者发生RA的风险显著升高，且对药物治疗的应答率和缓解率均明显降低。然而，肥胖加剧RA的具体分子与细胞机制尚未被充分阐明。

已有研究表明，肥胖可通过脂肪组织分泌瘦素、脂联素及促炎因子（如TNF-α、IL-6）促进系统性慢性炎症。在胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）小鼠模型中，肥胖可促进Th17细胞分化及IL-17产生，从而加重关节炎症。然而，Th17/IL-17通路并不能完全解释肥胖相关RA的全部病理机制。组织驻留记忆T细胞（tissue-resident memory T cells, TRM）是一类长期驻留于外周组织的记忆T细胞亚群，在多种自身免疫病的慢性化和复发中发挥关键作用。TGF-β信号通路是TRM细胞分化和组织驻留的关键调控通路，但其在肥胖加剧RA中的作用尚未被系统研究。

本研究旨在利用高脂饮食（high-fat diet, HFD）诱导的肥胖CIA小鼠模型，结合无标记定量蛋白质组学（label-free quantitative proteomics）和质谱流式细胞术（cytometry by time-of-flight, CyTOF）等高通量技术，系统解析肥胖加剧RA的分子和细胞机制，并探索潜在的治疗靶点。

三、研究流程与方法

本研究以DBA/1小鼠为实验对象，该品系较常用的C57BL/6小鼠在HFD条件下可诱导更严重的CIA，因此更适合用于肥胖与关节炎关系的研究。实验设计分为以下几个主要环节：

1. 肥胖CIA模型的建立与分组。 20只8周龄雄性DBA/1小鼠在适应性饲养1周后，随机分为正常饮食（normal diet, ND）组和HFD组（60% kcal脂肪），持续干预7周。16周龄时，在每种饮食组内进行第二次随机化，进一步分为：肥胖CIA组（5只）、肥胖对照组（5只）、瘦CIA组（5只，实验过程中1只死亡，最终n=4）和瘦对照组（5只）。CIA诱导采用鸡II型胶原（chicken type II collagen, CII）与完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant, CFA）乳化液皮内注射，2周后加强免疫。对照组仅注射CFA乳液。每周监测体重，处死前进行全身磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）评估体脂分布，并检测血清甘油三酯和总胆固醇水平。

2. 组织病理学评估。 小鼠膝关节经固定、EDTA脱钙、石蜡包埋后切片，进行苏木精-伊红（H&E）染色和甲苯胺蓝染色，分别评估滑膜炎症和软骨蛋白聚糖丢失。由两名对分组不知情的研究者独立进行组织学评分。

3. 无标记定量蛋白质组学分析。 分离各组小鼠腘窝淋巴结淋巴细胞，裂解、酶解后进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，使用TIMS-TOF Pro质谱仪。质谱数据采用MaxQuant软件（版本1.6.14.0）进行数据库检索和无标记定量。差异表达蛋白（differentially expressed proteins, DEPs）定义为组间表达倍数变化≥1.5且p<0.05（Student’s t检验）。随后进行基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析、KEGG通路富集分析和亚细胞定位分析。

4. CyTOF高维免疫分析。 对淋巴细胞进行刺激、死活染色、固定、破膜后，使用包含20个表面标志物和转录因子的抗体组合进行染色，包括CD3、CD4、CD8、CD44、CD62L、CD69、CD103、ITGB2、Eomes、KLF2、T-bet、RORγt、Foxp3等。数据经Helios质谱流式系统采集，使用Cytobank平台进行viSNE降维可视化，FlowSOM算法进行无监督聚类，识别出12个免疫细胞亚群（metaclusters）。关键两两比较采用Mann–Whitney U检验，并进行事后统计功效分析。

5. 药物干预实验。 使用积雪草苷（asiaticoside），一种已知的TGF-β/Smad信号通路抑制剂，以20 mg/kg/天的剂量经口服灌胃给予肥胖CIA小鼠，持续21天。对照组给予等体积玉米油载体。干预结束后进行组织学评估和CyTOF分析，比较Th17、TRM亚群比例变化。

6. 多重免疫荧光验证。 对小鼠滑膜组织和骨髓组织进行多重免疫荧光染色，检测CD3、CD44、CD69、Eomes和KLF2的表达和共定位。此外，对来自仁济医院的4例RA患者滑膜组织样本（2例高BMI、2例低BMI）进行H&E染色和免疫荧光分析，初步探索TRM样细胞在肥胖RA患者中的富集情况。

四、主要研究结果

1. 肥胖显著加重CIA严重程度。 HFD喂养的小鼠体重、血清甘油三酯和总胆固醇水平均显著高于ND组。肥胖CIA小鼠的临床关节炎评分（p=0.0007）、滑膜炎症评分（p=0.001）和软骨损伤评分（p=0.0008）均显著高于瘦CIA小鼠。组织学显示肥胖CIA小鼠滑膜水肿、增生、炎细胞浸润和血管翳形成更为严重。

2. 蛋白质组学揭示肥胖CIA小鼠的分子特征。 在肥胖CIA与瘦CIA小鼠淋巴细胞间共鉴定出26个DEPs，其中15个上调、11个下调。上调蛋白包括免疫相关蛋白Ighg、肥大细胞蛋白酶（Mcpt4、Cma1、Cpa3）、产热标志物Ucp1和脂质代谢调节因子Apoe。下调蛋白中尤为重要的是两个转录因子Eomes（0.49倍，p=0.011）和KLF2（0.44倍，p=0.042），以及代谢酶Hsd11b1等。此外，肥胖CIA小鼠还表现出14个特异性表达的蛋白，包括Igha、Siglec10和Lama4等。GO富集分析显示DEPs富集于T细胞介导的细胞毒性、颗粒酶介导的凋亡信号通路等生物学过程；KEGG通路分析显示肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system, RAS）是最显著富集的通路。亚细胞定位分析提示DEPs主要定位于细胞核，暗示转录调控的紊乱。

3. TGFβ信号通路与TRM相关蛋白的协同变化。 蛋白质组数据进一步显示，肥胖CIA小鼠中TGFβ受体II（TGFβRII）表达显著上调，而TGFβ在肥胖对照组中反而下调，提示肥胖与关节炎诱导存在“协同效应”导致TGFβR信号从抑制状态反转为过度激活。同时，TRM标志物CD103显著上调。KLF2在肥胖CIA小鼠中的抑制较肥胖对照组更为显著。免疫荧光验证显示，肥胖CIA小鼠骨髓中Eomes和KLF2的核内平均荧光强度分别下降45.1%（p<0.01）和42.2%（p<0.05）。Western blotting证实肥胖CIA小鼠中磷酸化Smad2/3水平显著升高，总Smad2/3无变化，确证了TGF-β/Smad经典通路的过度激活。在单细胞水平，潜伏相关肽（latency-associated peptide, LAP）在CD44⁺CD69⁺T细胞及CD103⁺TRM细胞表面表达显著上调。

4. CyTOF揭示肥胖对T细胞亚群的深刻重塑。 FlowSOM无监督聚类识别出12个免疫细胞亚群，其中包括典型的CD103⁺TRM亚群（MC10，CD103⁺CD69⁺CD25⁺CD44⁺）和ITGB2⁺TRM样亚群（MC11，CD44⁺⁺⁺⁺ITGB2⁺⁺CD3⁺⁺CD103⁻）。在CD3⁺T细胞中，肥胖CIA小鼠的CD4⁺T细胞比例显著降低（p=0.017），CD8⁺T细胞比例呈升高趋势。CD4⁺T细胞中RORγt⁺Th17细胞比例显著升高（p=0.023），而T-bet⁺Th1细胞无显著变化。CD44⁺CD62L⁻记忆T细胞（p=0.017）和CD44⁺CD62L⁻CD69⁺TRM细胞（p=0.0087）均显著增加。进一步分析显示，在TRM池内，CD103⁺TRM细胞增加3.0倍（p=0.0043），ITGB2⁺TRM细胞增加2.0倍（p=0.0042）。该关键发现的效应量极大（Cohen’s d=3.75），事后统计功效达99.98%。Spearman相关分析显示，CD103⁺TRM频率与炎症评分（r=0.94, p<0.0001）和软骨损伤评分（r=0.89, p=0.0012）强正相关。ITGB2⁺TRM频率也与炎症评分（r=0.78, p=0.012）和软骨损伤评分（r=0.82, p=0.0065）显著正相关。此外，肥胖CIA小鼠中CD4⁺和CD8⁺T细胞谱系内的TRM亚群均发生扩张，且Hobit富集的CD103highPD1low亚群和颗粒酶K富集的CD103lowPD1high亚群均显著增加。功能分析显示，肥胖CIA小鼠CD44⁺CD62L⁻CD69⁺T细胞、CD69⁺CD103⁺TRM和CD69⁺ITGB2⁺TRM中IFN-γ表达均显著升高。

5. 积雪草苷通过抑制TGFβR通路减轻关节炎并降低TRM比例。 积雪草苷治疗21天后，肥胖CIA小鼠的滑膜炎症评分（p=0.032）和软骨损伤评分（p=0.014）均显著降低。CyTOF分析显示，治疗组RORγt⁺Th17细胞比例显著降低（p=0.033），CD103⁺TRM比例下降27.15%（p=0.040），ITGB2⁺TRM比例下降15.70%（p=0.048）。同时，积雪草苷显著降低了上述三个T细胞亚群中IFN-γ的表达水平。多重免疫荧光证实，肥胖CIA小鼠滑膜组织中CD3⁺CD44⁺CD69⁺TRM样细胞密度和阳性面积均显著高于瘦CIA小鼠，积雪草苷治疗则显著降低这两个指标。

6. 人类RA样本的初步观察。 在高BMI（32.0）RA患者滑膜中观察到急性加重的慢性炎症、纤维素性渗出和结构化的淋巴样聚集体，以及CD3⁺CD44⁺CD69⁺TRM样细胞的显著积聚。低BMI（21.3）患者则表现为中度慢性滑膜炎，TRM样细胞稀少。多区域定量分析显示高BMI样本中CD69阳性面积和TRM样细胞密度均显著增加，与小鼠模型结果一致。

五、结论与研究价值

本研究首次揭示了“肥胖–TGFβ–TRM”致病轴在肥胖加剧CIA中的核心作用。在这一轴中，肥胖作为“第一次打击”，重塑了免疫基线状态，使TGFβR信号处于预适应状态；CIA诱导作为“第二次打击”，在肥胖背景下触发TGFβR信号的致病性反转，导致TGF-β/Smad通路的过度激活。过度激活的TGFβ信号进一步抑制Eomes和KLF2的表达，促进CD103⁺和ITGB2⁺TRM细胞的分化和组织驻留，最终加剧关节炎症和软骨破坏。积雪草苷通过抑制TGFβR/Smad信号，降低了TRM细胞比例并改善了关节炎症状，为该轴的治疗靶向性提供了药理学证据。

本研究的科学价值在于：将肥胖相关的免疫代谢紊乱与TRM细胞生物学联系起来，阐明了肥胖加剧RA的新机制；为“肥胖相关RA”这一临床亚型提供了分子分型和靶向治疗的潜在策略。应用价值方面，TGFβRII靶向单克隆抗体（如fresolimumab）和脂肪酸代谢靶向治疗有望成为肥胖相关RA的精准治疗手段。此外，这一致病轴可能具有超越RA的广泛意义，在银屑病、多发性硬化等TRM介导的自身免疫病中也可能发挥类似作用。

六、研究亮点

本研究的主要亮点包括：（1）发现了肥胖–TGFβ–TRM这一全新的致病轴，将代谢紊乱与组织驻留免疫细胞的病理功能联系起来；（2）采用无标记定量蛋白质组学与CyTOF高维免疫分析相结合的多组学策略，在蛋白表达和单细胞水平实现了从分子到细胞亚群的系统解析；（3）鉴定了CD103⁺TRM和ITGB2⁺TRM两个功能差异化的致病性亚群，并揭示了其在肥胖CIA中的差异性扩张；（4）利用积雪草苷进行药理学干预，初步验证了TGFβR/TRM轴作为治疗靶点的可行性；（5）通过人类RA滑膜样本的初步分析，提示了该机制的临床转化潜力。

七、研究局限性

作者在讨论中明确指出本研究存在若干局限性，包括：CIA诱导时小鼠年龄偏大可能对结果产生潜在影响；未进行体内TRM细胞清除实验以正式确立其因果作用；两个瘦CIA组间存在轻微批次效应不能完全排除；缺乏“仅积雪草苷”对照组；人类RA样本量偏小且为初步相关分析。此外，肥胖相关代谢信号（如游离脂肪酸）如何直接调控TGFβR–TRM轴的分子机制尚待阐明。