一项关于无需开颅建立大鼠可逆性大脑中动脉闭塞模型的研究报告

本研究的主要作者是 Enrique Zea Longa, Philip R. Weinstein, Sara Carlson 和 Robert Cummins。研究发表于 《Stroke》 期刊，具体为 1989年 第20卷，第84-91页。作者团队来自加州大学旧金山分校医学院神经外科系、旧金山退伍军人管理局医院以及旧金山拉尔夫·K·戴维斯医疗中心的显微外科实验室。

一、 学术背景 本研究属于脑缺血病理生理学领域。长期以来，研究人员利用大鼠通过多种方法研究脑缺血，例如多血管闭塞、低血压和低血容量，以产生全脑血流和代谢的改变。然而，研究者们一直致力于寻找一种可靠、创伤更小的大鼠局灶性脑缺血模型，特别是可逆性的缺血模型。这一需求的驱动因素包括：大鼠已积累了大量的神经化学数据、使用大型动物进行实验的成本日益增高，以及已有的其他啮齿动物局灶性脑缺血模型（如沙鼠的颈总动脉或大脑中动脉闭塞模型）存在局限性。之前虽有通过开颅术直接显微外科闭塞大脑中动脉(Middle Cerebral Artery, MCA)的方法，但创伤较大。因此，本研究的目标是开发一种简单、相对无创、无需开颅的大鼠可逆性局灶性脑缺血模型，旨在模拟人类脑血管闭塞性疾病，并用于评估再灌注以及其他生理操作或治疗的效果。

二、 详细工作流程 本研究分为初步研究和确认性研究两个主要部分，共涉及94只大鼠（初步研究60只，确认性研究34只）。研究对象为成年雄性斯普拉格-道利(Sprague-Dawley)大鼠。

• 动物准备与监测：在初步研究中，大鼠使用氯胺酮和乙酰丙嗪麻醉。确认性研究中，则使用1%异氟烷吸入麻醉。所有大鼠均通过股动脉置管连续监测动脉血压并采集血样进行血气分析和血红蛋白浓度测定。体温通过红外线加热灯和加热垫维持在37°C。部分大鼠还进行了经皮针电极脑电图监测，以记录大脑电活动。

• 核心手术方法——无需开颅的MCA可逆性闭塞术： 本研究的关键创新在于建立了一种无需开颅的MCA闭塞与再通技术。其核心步骤如下：

  1. 颈部血管解剖：在显微镜下，暴露右侧颈总动脉。分离并电凝颈外动脉的所有分支（枕动脉、甲状腺上动脉、咽升动脉等）。进一步分离颈内动脉，并结扎其颅外分支——翼腭动脉。
  2. 引入腔内缝线：在颈外动脉残端置一松的丝线结扎线，并在颈总动脉和颈内动脉起始部放置微血管夹。将一段头端经火焰烧灼变钝的4-0（部分初步研究中使用5-0）单丝尼龙缝线，通过穿刺或颈外动脉终末分支引入颈外动脉管腔。
  3. 闭塞MCA：收紧颈外动脉残端的丝线以防出血，移除微血管夹。随后，将尼龙缝线从颈外动脉轻柔地推进至颈内动脉管腔，并继续向颅内方向推进。当感受到阻力，并观察到缝线轻微弯曲或颈内动脉被拉伸时，表明缝线的钝头已通过MCA起始部，到达了直径更小的前大脑动脉起始处。此时，缝线堵塞了MCA的起源，阻断了来自颈内动脉、前大脑动脉和后大脑动脉的血流。
  4. 实现再灌注：缝合切口，将约1厘米的尼龙缝线留在体外。恢复MCA血流时无需再次麻醉，只需将缝线向外拔出直至感到阻力（提示缝线尖端已退出前大脑动脉-颈内动脉管腔，进入颈外动脉残端），然后修剪掉多余部分即可。

• 辅助操作与对照组设计： 为了减少侧支循环、增强MCA闭塞的缺血效果，研究还测试了其他血管闭塞方式，包括：左侧颈内动脉闭塞、双侧椎动脉闭塞。同时设立了对照组，例如仅闭塞颈外动脉分支、仅进行颈部血管解剖并放置缝线（假手术组）等，以验证手术操作本身不引起脑卒中。

• 实验分组与流程：

  • 初步研究（8组，共60只大鼠）：测试了不同的血管组合闭塞方案，以筛选最佳方法。评估了神经功能缺损、死亡率、大体病理，部分动物还进行了脑电图和印度墨汁灌注研究以验证血流阻断与恢复。
  • 确认性研究（5组，34只大鼠）：基于初步研究结果，选择了最佳方案进行标准化验证。手术技术标准化为：使用头端更圆钝的4-0缝线，精确插入颈内动脉17毫米。分组包括：A组（假手术）、B组（永久性MCA闭塞）、C组（2小时暂时性MCA闭塞后恢复灌注）、D组（4小时暂时性MCA闭塞后恢复灌注）、E组（双侧椎动脉闭塞后立即行永久性MCA闭塞）。

• 评估指标：

  1. 神经功能评分：术后定期进行神经学检查，采用0-4分五级评分标准（0分无缺损，1分轻度，2分中度，3分重度，4分不能自发行走且意识水平下降）。
  2. 病理学评估：所有存活大鼠在闭塞开始72小时后被处死取脑。部分大脑用于印度墨汁灌注，直观验证MCA血流阻断或恢复。通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色或常规石蜡切片苏木精-伊红染色评估梗死区域。使用极面求积法测量冠状切片的梗死面积百分比，并进行统计分析（Kruskal-Wallis检验）。
  3. 生理参数监测：全程监测并记录动脉血氧分压、二氧化碳分压、pH值、收缩压和血红蛋白浓度，确保缺血模型不因全身生理状态紊乱而产生。

三、 主要研究结果 * 生理稳定性：所有实验组大鼠的心肺功能保持稳定，动脉血气、血压等参数在麻醉期间未发生显著变化，表明该模型能可靠地产生区域性缺血，而不引起低血压或缺氧。 * 初步研究结果：确定了最佳MCA闭塞方法。印度墨汁灌注在14只永久闭塞大鼠中证实了MCA血流阻断，在6只暂时闭塞大鼠中证实了MCA血流恢复。单独MCA闭塞（组1）或合并对侧颈内动脉闭塞（组2）仅产生轻度、可缓解的神经功能缺损和较小的梗死。而MCA闭塞合并双侧椎动脉闭塞（组3）能产生中度且持续的神经功能缺损（平均评分2.3），并在10只大鼠中的6只形成了累及额顶叶皮质和皮层下基底节的MCA分布区梗死。 * 确认性研究结果： 1. 神经功能缺损：永久性MCA闭塞（B组）在2小时后的平均评分为1.6，72小时后降至0.7。暂时性MCA闭塞（C组和D组）的神经功能评分与永久闭塞组无显著差异，表明再灌注并未显著改善神经功能缺损。 2. 梗死面积：永久性MCA闭塞（B组）产生的神经元损伤平均占冠状切面面积的37.6% ± 5.5%，即接近大脑半球面积的75%。2小时暂时性闭塞（C组）和4小时暂时性闭塞（D组）的平均梗死面积分别为21.9% ± 14.5%和25.7% ± 13.4%，均显著小于永久闭塞组。这表明再灌注虽然未能改善行为学评分，但缩小了最终的梗死体积。所有组的梗死均涉及皮质和皮质下区域。 3. 脑电图变化：监测显示，2小时暂时性MCA闭塞后，双侧脑电图波幅均下降，缺血半球下降更明显。再灌注2小时后，波幅未显著恢复，与神经功能缺损的结果一致。 4. 死亡率和并发症：在总共71只接受MCA闭塞术的大鼠中，仅2只在初步研究阶段因缝线穿孔导致颅内出血死亡，技术标准化后无类似并发症。双侧椎动脉闭塞后立即行MCA闭塞（E组）产生了最广泛的缺血损伤，但也导致大量失血和60%的高死亡率。4小时暂时性MCA闭塞（D组）死亡率也高达50%。 5. 对照组结果：假手术组大鼠未出现神经功能缺损或脑梗死，证实了手术操作本身的控制是有效的。

四、 研究结论与意义 本研究成功开发并验证了一种无需开颅、利用颈内动脉腔内缝线技术实现大鼠大脑中动脉可逆性闭塞的可靠模型。该模型通过阻断颅外颈内动脉分支减少侧支血流，并通过向颅内推进缝线机械性阻塞MCA起源，实现了MCA分布区的局灶性缺血。再灌注可通过简单撤出缝线实现。

该模型的科学价值在于： 1. 可靠性高：标准化操作（使用4-0缝线插入17mm）可在300-400g大鼠中稳定产生区域性梗死。 2. 创伤性小：避免了开颅手术的创伤和复杂性，更接近临床脑血管闭塞性疾病的病理过程。 3. 可逆性强：能够方便地模拟缺血再灌注过程，为研究再灌注损伤和治疗干预提供了理想平台。 4. 适用性广：适用于研究永久性和暂时性脑缺血，可用于模拟人类脑血管闭塞性疾病，并评估再灌注、各种生理调控或药物治疗的效果。

五、 研究亮点 1. 方法学的创新性：首创了通过颅外血管路径、利用腔内缝线实现MCA可逆性闭塞的技术，是该领域里程碑式的模型建立研究，后被广泛称为“线栓法”(filament model)。 2. 系统性验证：研究不仅描述了方法，还通过初步研究筛选参数，通过确认性研究严格验证了模型的稳定性、可重复性和有效性，并设置了完善的对照组。 3. 多维度评估：结合了神经行为学评分、生理监测、脑电图、印度墨汁血管灌注、大体病理、组织化学染色（TTC）和组织学检查（H&E染色）等多种手段，全面评估了模型的缺血效果和结局。 4. 揭示了重要现象：研究发现，尽管再灌注缩小了梗死面积，但并未显著改善短期（72小时）神经功能评分，且4小时缺血后再灌注死亡率很高，提示了缺血损伤的不可逆性可能发生较早，且再灌注本身可能存在风险，这一发现对理解脑缺血病理生理和制定治疗时间窗有重要意义。

六、 其他有价值的内容 研究还探讨了大鼠脑血管解剖与人类的相似性，解释了缝线如何通过阻塞前大脑动脉起始部来有效阻断MCA血流及其侧支循环（包括来自后大脑动脉的侧支）。同时，研究观察到双侧脑电图变化，推测可能是MCA闭塞后引起的神经功能联系中断所致。这些讨论加深了对模型机制的理解。作者也指出，虽然印度墨汁和组织学研究证实了血管再通，但无法排除远端栓塞或微循环血栓形成的可能性，指出了该模型的潜在局限性，体现了研究的严谨性。