本研究由Yana Hu、Qizheng Zhang、Tianli Hu、Juewen Liu、Hongxing Fu、Xin Zhao、Zijiang Yang及Chenjie Xu等人合作完成，主要作者分别来自香港城市大学生物医学工程系、滑铁卢大学化学系、浙江大学医学院第二附属医院、香港理工大学生物化学技术系及清华珠三角研究院多能干细胞研究中心。该研究成果以研究论文形式发表于*Advanced Materials Technologies*期刊，于2026年收录，文章编号为e01702，DOI为10.1002/admt.202501702。

该研究属于生物医学工程与纳米生物技术交叉领域，聚焦于利用纳米探针技术对活体β细胞及胰岛内胰岛素信使RNA（mRNA）进行实时动态监测。胰岛素是维持机体血糖稳态的关键激素，β细胞的功能状态与其胰岛素基因表达水平密切相关。在干细胞分化来源的β细胞规模化生产中，监测胰岛素mRNA表达对于判断细胞成熟度和治疗潜能至关重要。传统mRNA检测方法如Northern印迹（Northern blot）和反转录聚合酶链反应（RT-PCR）虽然准确性高，但过程耗时且需裂解样本，无法实时反映活细胞内的转录动态。因此，开发能够非侵入式、实时监测活细胞中胰岛素mRNA的方法具有重要意义。本研究的目的是发展一种基于球形核酸（spherical nucleic acid, SNA）技术的纳米耀斑（nanoflare, NF）传感器，用于在二维和三维培养环境中对胰岛素mRNA进行特异性检测。

研究流程主要分为三个关键步骤：识别链的设计与筛选、纳米传感器的合成与表征、以及传感器在二维和三维生物体系中的应用验证。第一步，研究者从NCBI数据库中获取小鼠胰岛素基因Ins2（人胰岛素基因的直系同源基因）的mRNA序列，并从PrimerBank数据库、NCBI网站的“Pick Primer”工具以及已发表文献三个来源获取候选引物。随后，利用NCBI的BLAST工具验证序列特异性，通过IDT OligoAnalyzer软件预测识别链-耀斑链双链体（recognition-flare duplex, RF duplex）与识别链-靶标双链体（recognition-target duplex, RT duplex）的结合自由能，并以RF/RT比值作为筛选参数。比值越低，表明识别链与靶标mRNA形成的双链体越稳定，越有利于靶标结合后释放耀斑链。从每个来源中选出一个具有最低RF/RT比值的候选识别链，分别命名为in2①-NF、in2②-NF和in2③-NF进行实验筛选。第二步，将这些识别链与荧光标记的耀斑链杂交后，利用冷冻-盐老化法将其偶联到15纳米金纳米颗粒上，合成三种纳米耀斑传感器。在无细胞体系中先以游离靶标链检测三种传感器的荧光恢复能力，随后在MIN6细胞中比较其细胞标记效率。根据筛选结果，in2③-NF表现出最高的检测效率和灵敏度且无聚集现象，因此被选定为进一步研究的对象，并重新命名为in2-NF。第三步，对in2-NF进行灵敏度、特异性、重现性和稳定性表征。将不同浓度的靶标链与in2-NF孵育后测量荧光强度，构建浓度-荧光信号标准曲线并计算检出限（limit of detection, LOD）。特异性通过加入完全互补靶标、单碱基错配靶标和PBS对照进行比较，并进一步在胰岛素分泌型MIN6细胞和非胰岛素分泌型B16F10细胞中验证。重现性通过在不同日期独立制备三批传感器进行比较，稳定性则通过将同一批传感器在4°C保存不同时间后重新检测荧光响应来评估。随后，将in2-NF应用于二维培养的MIN6细胞、三维MIN6细胞球体及大鼠胰岛中，观察其检测细胞胰岛素mRNA的能力，并与qPCR结果进行对比验证。

研究结果显示，在三种候选纳米耀斑中，in2③-NF对靶标链的响应最为显著。当靶标链浓度为2 µM时，in2③-NF的荧光强度超过1000，而in2①-NF仅呈现缓慢增加，in2②-NF始终维持在20至40的低水平。MIN6细胞的荧光成像定量分析同样显示in2③-NF标记的细胞荧光最强，in2②-NF组最弱。进一步机制分析发现，in2①-NF的识别链可形成两个稳定的发夹结构（ΔG分别为-3.57 kcal/mol和-3.37 kcal/mol），暴露的单链“粘性末端”可引起颗粒间交联，导致聚集和检测效率下降。in2③-NF则无稳定发夹结构，表现为开放的识别区域，因此性能最优。in2-NF在加入完全互补靶标后60分钟内荧光信号增加了24倍，而对照组无明显变化。在0至0.1 µM范围内，荧光强度与靶标浓度之间呈现极好的线性关系，决定系数r²为0.9997，斜率为8647 RFU/µM，检出限为3.136 nM。检测效率约为30%，而单碱基错配组和PBS对照组均保持在背景水平，说明该传感器具备强序列特异性。三批独立制备的传感器荧光响应无显著差异，同一批传感器在一周内荧光响应也无明显衰减，证明了良好的重现性和稳定性。在二维MIN6细胞实验中，随着in2-NF的加入浓度从OD 0.1提高至OD 2，细胞荧光强度逐渐增强。在48小时连续培养过程中，荧光信号从4小时到48小时持续增加；48小时洗涤后信号逐渐下降，表明荧光分子的持续释放和清除。qPCR与in2-NF信号均显示Ins2表达先升高后趋于稳定，但qPCR在第二天达到峰值，而in2-NF信号在第三天到达峰值。造成该时间差异的原因可能是第三天MIN6细胞聚集成密集岛状结构，导致细胞计数偏低，进而造成平均荧光信号偏高和峰值的延迟。在三维实验中，in2-NF能够有效渗透至约250 µm直径的MIN6细胞球体内部并在16小时后观察到荧光信号；而在直径约150 µm的大鼠胰岛中，仅4小时即实现核心区域的荧光标记，显示出较强的组织穿透能力。

本研究开发了一种靶向Ins2 mRNA的球形核酸纳米耀斑传感器in2-NF，能够在活细胞和离体组织中非侵入地监测胰岛素mRNA表达。该传感器在选择识别链时结合了数据库搜索、文献筛选以及软件模拟和实验验证，策略上具有系统性。其灵敏度、特异性、重现性和稳定性均得到了实验验证，并在二维和三维模型中展示了实时、动态监测细胞胰岛素mRNA的能力。虽然该传感器对靶标链的释放效率仅约30%，但作者提出可通过调节识别链在金纳米颗粒表面的密度来提高杂交效率并降低生产成本。此外，该研究还指出MIN6球体与大鼠胰岛之间的响应时间差异不能仅以样本尺寸解释，细胞外基质成分、组织密度和结构组织等因素可能影响探针渗透和信号积累，这为进一步研究提供了方向。整体而言，该研究拓展了纳米耀斑技术在β细胞生物学研究中的应用，为干细胞衍生β细胞的功能评价提供了潜在工具，也有望用于糖尿病细胞替代治疗中的质量控制与优化。该研究的创新之处在于开发了可用于三维组织环境的高效mRNA传感器，并系统性地优化了识别链序列选择方法，为后续纳米传感器设计提供了可行参考。