本研究由华中农业大学农业微生物国家重点实验室、湖北洪山实验室、兽医学院及生猪健康养殖协同创新中心的Jian Du、Chunwei Li、Jiyuan Luo、Huizhi Zhang等研究人员，联合湖北省肿瘤医院（华中科技大学同济医学院）的Hongli Xu，以及湖北江夏实验室的Xiangmin Li和Ping Qian共同完成。通讯作者为Hongli Xu、Xiangmin Li和Ping Qian。该研究于2026年2月9日投稿，2026年5月29日修订，2026年6月2日被接收，发表在《Advanced Science》期刊上（DOI: 10.1002/advs.76122）。
日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是一种经蚊媒传播的嗜神经性黄病毒（flavivirus），对人类健康和畜牧业构成严重威胁。JEV感染可导致严重的病毒性脑炎，尤其在儿童中致死率高，幸存者常遗留长期神经系统后遗症。尽管疫苗研发取得了进展，但JEV的致病机制及宿主抗病毒应答的调控机制仍不完全清楚，亟需揭示病毒-宿主互作中的关键调控节点。
表观转录组学（epitranscriptomics）调控，特别是N6-甲基腺苷（m6A）RNA修饰，已成为病毒-宿主互作研究的焦点。m6A是真核生物mRNA中最普遍的内部化学修饰，由甲基转移酶复合体（如METTL3/METTL14/WTAP）催化沉积，可被去甲基酶（如FTO、ALKBH5）移除，并由阅读蛋白（reader proteins）识别，进而影响RNA剪接、出核、稳定性和翻译。已有研究表明，多种RNA病毒（包括HIV、流感病毒、寨卡病毒）可利用或重塑宿主m6A景观以优化其复制或逃避免疫监视。然而，在JEV感染过程中m6A修饰如何被动态调控，以及其如何与特定RNA结合蛋白协同作用，仍是未解之谜。
自噬（autophagy）是保守的分解代谢途径，在病毒感染中发挥情境依赖性作用。虽然自噬可通过异体自噬清除病毒组分发挥抗病毒防御功能，但包括JEV在内的许多病毒已进化出劫持自噬途径的策略。TRIM25作为E3泛素连接酶，经典功能是催化RIG-I的K63连接泛素化以激活I型干扰素信号通路，但其是否通过调控自噬影响JEV复制尚不清楚。
本研究旨在阐明ZNF33B（一种C2H2锌指蛋白）如何整合m6A修饰与自噬调控，进而促进JEV感染的分子机制。
1. ZNF33B对m6A修饰及JEV复制的影响研究
研究首先检测JEV感染对细胞m6A修饰的影响，通过免疫荧光和免疫印迹发现JEV感染增加m6A信号及甲基转移酶METTL3和METTL14的蛋白丰度。随后在HEK293T和PK15细胞中通过m6A斑点杂交、RNA免疫共沉淀（RIP）等实验证实ZNF33B过表达增加m6A水平，而敲除ZNF33B则降低m6A水平。通过使用甲基化抑制剂3-脱氮腺苷（DAA）、敲低METTL3或过表达去甲基酶FTO，证明ZNF33B促进JEV复制依赖于细胞高m6A修饰水平。进一步通过共免疫共沉淀和免疫荧光共定位实验，发现ZNF33B选择性结合METTL14、WTAP、YTHDF2和YTHDF3，并促进METTL3-METTL14异二聚体复合物的稳定形成，从而增强m6A甲基转移酶复合物活性。
2. 多组学鉴定TRIM25为ZNF33B关键靶标
研究对JEV感染和未感染的SK6细胞进行RIP-seq和RNA-seq分析。RIP-seq鉴定的富集motif为“RGAC”，与经典m6A DRACH序列一致。通过交集RIP-seq和RNA-seq数据，筛选出ZNF33B潜在靶基因DHX58、TRIM25、ZNFX1和CORO1A。RIP-qPCR、qPCR和免疫印迹实验证实ZNF33B对TRIM25具有最强的结合亲和力和抑制能力，过表达ZNF33B显著降低TRIM25 mRNA和蛋白水平，敲除ZNF33B则增强TRIM25蛋白表达。
3. ZNF33B通过m6A依赖性方式促进TRIM25降解
通过SRAMP工具预测TRIM25 mRNA上三个高置信度m6A位点（c.1492、c.1567、c.1669 bp）。构建TRIM25野生型及突变体（mut1、mut2、mut3，将腺苷酸A替换为鸟苷酸G）。RIP-qPCR和FISH实验表明ZNF33B特异性结合c.1567和c.1669位点的m6A修饰。放线菌素D实验显示ZNF33B显著缩短TRIM25 mRNA半衰期，而METTL3敲低可逆转该效应。DAA处理、FTO过表达及METTL3敲低均能恢复ZNF33B抑制的TRIM25蛋白水平。
4. TRIM25通过抑制自噬流抑制JEV复制
在HEK293T和SK6细胞中过表达TRIM25，通过免疫印迹、空斑实验和免疫荧光证实TRIM25剂量依赖性地抑制JEV E、NS3和NS5蛋白表达及病毒滴度。GFP-LC3点状聚集实验、mCherry-GFP-LC3串联荧光报告系统及巴弗洛霉素A1（Baf.A1）处理实验表明，TRIM25过表达减少LC3-II蛋白水平、增加SQSTM1/p62水平，抑制自噬体和自噬溶酶体的形成，从而抑制自噬流。
5. TRIM25靶向ATG7调控自噬
通过BioGRID数据库与自噬通路蛋白的交叉分析，筛选出ATG5、ATG7和ATG12为TRIM25潜在靶标。免疫共沉淀和共聚焦实验证实TRIM25与ATG5和ATG7存在相互作用。CHX追踪实验表明，TRIM25过表达加速ATG7蛋白降解，但不影响ATG5或ATG12的降解速率；TRIM25敲低则延长ATG7半衰期。
6. TRIM25通过K48连接泛素化促进ATG7蛋白酶体降解
MG132处理实验证明TRIM25介导的ATG7降解依赖于蛋白酶体途径。泛素化实验显示TRIM25增强ATG7的K48连接泛素化而非K63连接泛素化。结构域截短实验表明TRIM25的SPRY结构域负责结合ATG7，而RING结构域是催化泛素化所必需的。RING结构域缺失突变体丧失促进JEV复制的能力。
7. ATG7泛素化位点的鉴定
利用GPS-Uber网站预测ATG7的泛素化位点，选择Lys389、Lys423和Lys652进行验证。构建ATG7突变体（K389R、K423R、K652R），发现K389R和K423R突变体抵抗TRIM25诱导的降解和泛素化，证明Lys389和Lys423是TRIM25介导ATG7泛素化的关键位点。
8. ZNF33B通过缓解TRIM25介导的自噬抑制促进JEV复制
ZNF33B过表达增加LC3-II、降低SQSTM1/p62水平，上调ATG5、ATG7和Beclin1蛋白。自噬抑制剂3-MA和氯喹处理消除ZNF33B对JEV复制的促进作用。共表达ZNF33B和TRIM25的回补实验表明，ZNF33B可逆转TRIM25对JEV NS3和ATG7蛋白的下调作用，并抑制TRIM25介导的ATG7泛素化。TRIM25 mut3突变体仍保留增强ATG7泛素化的能力，但ZNF33B无法拮抗其功能，证实ZNF33B通过m6A修饰位点发挥调控作用。
9. 体内验证ZNF33B加剧JEV神经病理损伤
采用腺相关病毒（AAV）介导的ZNF33B递送建立小鼠模型。AAV-ZNF33B组小鼠在JEV感染后表现出更严重的临床症状（后肢麻痹、震颤）、更早的死亡时间、更显著的体重下降、更高的IL-1β和IL-6炎症因子水平，以及更严重的脑组织病理损伤（脑水肿、神经细胞变性坏死、炎性细胞浸润）。AAV-ZNF33B组脑组织中JEV E、NS3和NS5蛋白水平显著升高，m6A修饰水平增加，TRIM25蛋白表达降低，ATG7蛋白表达升高。
研究发现ZNF33B是一个被JEV劫持的促病毒宿主因子。ZNF33B通过招募METTL14稳定METTL3-METTL14甲基转移酶复合物，增强全局m6A沉积。多组学分析鉴定TRIM25为ZNF33B的关键靶标，ZNF33B选择性结合TRIM25 mRNA上c.1567和c.1669位点的m6A修饰，加速其降解。TRIM25作为E3泛素连接酶催化ATG7在Lys389和Lys423位点的K48连接泛素化，导致ATG7蛋白酶体降解，从而抑制自噬流。ZNF33B介导的TRIM25降解解除了其对自噬的抑制作用，为病毒复制创造了有利环境。体内实验证实AAV介导的ZNF33B递送增加小鼠脑m6A水平、降低TRIM25表达、升高ATG7丰度、加剧JEV诱导的神经病理损伤并加速小鼠死亡。
本研究首次揭示了一条全新的ZNF33B-m6A-TRIM25-ATG7自噬调控轴，阐明了JEV劫持宿主表观转录组机制以逃避免疫监视的新策略。该发现不仅为黄病毒致病机制提供了新的机制性见解，也为以表观转录组-自噬串扰为靶点的宿主导向抗病毒治疗策略提供了潜在靶标。从应用角度看，ZNF33B、TRIM25及m6A修饰相关因子可能成为抗JEV药物开发的候选靶点。