流感病毒广谱多表位疫苗的计算机辅助设计研究

作者及机构
本研究由Lifang Yuan、Xu Li、Mincaho Li等来自中山大学公共卫生学院（深圳）、湘南大学基础医学院病原生物学与免疫学系、深圳数字生命研究所等机构的研究团队合作完成，发表于2023年11月的《International Journal of Biological Macromolecules》（期刊号254:128071）。通讯作者为中山大学的Yuelong Shu和Caijun Sun。

学术背景
流感病毒因其快速突变能力导致季节性流行甚至大流行，而现有疫苗常因病毒抗原漂移（antigenic drift）或转换（antigenic shift）导致保护效力下降（仅10%-60%）。传统疫苗靶向血凝素（hemagglutinin, HA）和神经氨酸酶（neuraminidase, NA）蛋白，但需每年更新毒株匹配。为突破这一局限，本研究提出基于免疫信息学（immunoinformatics）方法设计一种广谱多表位疫苗（multiepitope vaccine, MEV），通过整合B细胞线性表位、细胞毒性T细胞（CTL）和辅助T细胞（HTL）表位，激发全面免疫应答。

研究流程
1. 表位筛选与验证
- 研究对象：12名受试者（6名接种四价流感疫苗者，6名感染者）的36份血清样本，采集时间点为接种/感染前（D0）、28天后（D28）及365天后（D365）。
- 实验方法：
- 抗体-肽微阵列（antibody-peptide microarray）：筛选HA和NA中与血清IgG结合的10氨基酸肽段，鉴定“强效肽”（D28 vs D0）和“长效肽”（D365 vs D0）。
- 免疫优势表位预测：从IEDB数据库获取已验证表位，通过AlphaFold2预测蛋白三维结构，筛选完全暴露于分子表面的表位。
- 数据分析：使用VaxiJen 2.0评估抗原性，AllergenFP和ToxinPred排除致敏性与毒性。

1. T细胞表位预测

   • CTL表位：通过IEDB MHC-I工具预测9-10氨基酸肽段，覆盖12种高频HLA-I等位基因（如HLA-A*02:01），筛选标准为百分位秩<0.5、免疫原性>0。
     
   • HTL表位：基于7种HLA-II等位基因（如HLA-DRB1*15:01），结合IFN-γ诱导能力（通过IFNepitope服务器预测）。
     

2. 保守性分析

   • 使用MAFFT和WebLogo对4579条HA/4389条NA序列（H1N1、H3N2和B型）进行比对，筛选氨基酸残基保守性>80%的表位。最终选定19个B细胞表位和18个T细胞表位。

3. MEV构建与优化

   • 结构设计：表位通过柔性连接子（如KK、AAY、GPGPG）串联，N端添加LC3B佐剂（增强抗原呈递），C端加入TLR4激动剂RS09（激活先天免疫），末端引入6×His标签便于检测。
     
   • 理化性质：通过ProtParam预测分子量（H1N1-MEV为43.1 kDa）、等电点（9.75）等，Protein-Sol验证溶解度（H1N1-MEV为0.471）。
     

4. 分子对接与动力学模拟

   • 对接分析：AlphaFold2预测MEV与TLR4（PDB:4G8A）的结合，H1N1-MEV形成19个氢键和11个盐桥，结合能稳定。
     
   • 动力学模拟：GROMACS进行100 ns模拟，RMSD显示复合物在20 ns后稳定（H1N1-MEV-TLR4波动范围2.10-2.12 nm），埋藏表面积约600 Ų。
     

5. 免疫模拟与克隆

   • C-ImmSim模拟：三次接种后，IgG/IgM抗体水平显著提升，IFN-γ和IL-2等细胞因子分泌增加，记忆B/T细胞扩增。
     
   • 体外克隆：通过JCat服务器优化密码子（CAI=1），插入pET28a(+)载体，证实可在E. coli中高效表达。

主要结果
1. 表位筛选：微阵列鉴定出21个B细胞表位（如H1N1-HA的VGTSRYSKKFKPEIA），8个HTL和13个CTL表位（如HLA-A*02:01结合的GVAPLHLGK）。
2. 疫苗设计：H1N1-MEV、H3N2-MEV和B-MEV均显示高抗原性（VaxiJen评分>0.5）、非致敏性，且结构稳定（Ramachandran图显示>94%残基位于允许区）。
3. 免疫应答：模拟显示MEV可激活Th1/Th2双通路，B细胞表位覆盖11个构象表位（Ellipro评分>0.69）。

结论与价值
本研究首次结合实验验证与计算预测，设计出针对H1N1、H3N2和B型流感病毒的广谱MEV，其优势包括：
- 科学价值：突破传统疫苗株匹配限制，表位保守性覆盖多亚型；LC3B佐剂增强T细胞应答的创新策略。
- 应用潜力：MEV可通过大肠杆菌规模化生产，为通用流感疫苗开发提供新范式。

研究亮点
1. 方法创新：整合抗体微阵列实验与免疫信息学工具，实现表位筛选的高通量和高精度。
2. 跨学科技术：结合AlphaFold2结构预测、GROMACS动力学模拟等前沿技术验证疫苗稳定性。
3. 广谱性设计：表位覆盖全球90.27%人群的HLA类型，且对抗原漂移具有潜在抵抗力。

补充价值
研究数据已公开于GISAID和IEDB数据库，为后续湿实验（如动物模型验证）奠定基础。