病毒核衣壳蛋白与人类RNA结合蛋白MEX3A共同促进安第斯正汉坦病毒小mRNA的翻译
本研究由智利圣地亚哥天主教大学（Pontificia Universidad Católica de Chile）医学院的Jorge Vera-Otarola（第一、二单位）， Estefania Castillo-Vargas（第一、三单位）， Jenniffer Angulo， 西班牙巴塞罗那科学与技术研究所生物医学研究所的Francisco M. Barriga， Eduardo Batlle， 以及通讯作者Marcelo Lopez-Lastra领导的团队完成。该项研究于2021年9月21日发表在《PLOS Pathogens》期刊上。
一、学术背景
该研究属于分子病毒学与细胞生物学交叉领域，聚焦于病毒-宿主相互作用，特别是病毒基因表达调控机制。研究对象安第斯正汉坦病毒（Andes orthohantavirus， ANDV）是南美洲汉坦病毒心肺综合征（Hantavirus Cardiopulmonary Syndrome, HCPS）的主要病原体，其独特之处在于可发生人际传播。ANDV的基因组包含三个负义单链RNA片段，其中小片段信使RNA（smRNA）编码病毒的核衣壳蛋白（N蛋白）和非结构蛋白。与绝大多数细胞mRNA和许多病毒mRNA不同，ANDV的smRNA缺乏3‘端多聚腺苷酸（poly(A)）尾。在真核细胞中，mRNA的翻译效率依赖于5’帽（cap）与3‘尾之间形成的非共价“闭合环”结构，该结构通常由帽结合复合体eIF4F和poly(A)结合蛋白（PABP）通过支架蛋白eIF4G介导形成，从而促进翻译起始和核糖体回收。因此，ANDV的smRNA如何在不依赖poly(A)尾的情况下实现高效翻译，成为一个关键的未解科学问题。此前研究表明，其他正汉坦病毒（如辛诺柏病毒SNV）的N蛋白可以刺激mRNA翻译，甚至可能替代宿主翻译起始因子eIF4F的功能。同时，本团队先前工作发现，ANDV smRNA的翻译依赖于其5‘帽结构和3’非翻译区（3‘UTR）。基于此，本研究旨在深入探究ANDV smRNA的翻译机制，具体目标包括：1）验证ANDV N蛋白是否具有促进翻译的能力及其作用方式（是否替代eIF4F）；2）鉴定能够结合smRNA 3’UTR并参与翻译调控的宿主细胞蛋白；3）阐明病毒蛋白与宿主蛋白如何协作，介导smRNA 5‘-3’末端相互作用，从而实现高效翻译。
二、详细研究流程
本研究设计了一系列体外和细胞实验，流程环环相扣，逻辑严谨。
第一部分：ANDV N蛋白在体外翻译系统中的作用表征 研究首先在无细胞体系中验证ANDV N蛋白的功能。研究人员利用细菌表达并纯化了带有GST标签的重组ANDV N蛋白（ANDV GST-N）。体外翻译体系采用核酸酶处理的兔网织红细胞裂解物（RRL）。作为底物，构建了两种体外转录的mRNA：一种是含有5‘帽和poly(A)尾的对照报告基因mRNA（cap-GLO-FLuc-poly(A)），另一种是模拟ANDV smRNA结构的报告基因mRNA，即5’帽、ANDV smRNA的5‘UTR、萤火虫荧光素酶（FLuc）开放阅读框（与N蛋白起始密码子同框）以及ANDV smRNA的3’UTR（cap-N-RNA-3‘UTR）。将纯化的ANDV GST-N蛋白以不同摩尔比（蛋白：RNA）加入RRL翻译体系中，检测FLuc活性。同时，设置仅添加GST蛋白的对照组。此外，为了验证翻译的帽依赖性，使用5’端为不能被eIF4E识别的帽子类似物（ApppG， ACap）的mRNA（ACap-N-RNA-3‘UTR）进行平行实验。为了评估ANDV N蛋白能否替代eIF4G的功能，研究人员使用口蹄疫病毒（FMDV）的L蛋白酶处理RRL，该蛋白酶能特异性切割eIF4G，破坏其与eIF4E的结合，从而抑制帽依赖性翻译。在eIF4G被切割的RRL体系中，加入ANDV GST-N蛋白，观察其是否能“拯救”cap-N-RNA-3‘UTR的翻译。每一步实验结束后，还通过实时定量RT-PCR检测了反应体系中mRNA的丰度，以排除蛋白添加影响mRNA稳定性进而导致荧光素酶活性变化的可能性。
第二部分：ANDV N蛋白在细胞中对smRNA翻译的促进作用 为了在更接近生理环境的背景下验证结果，研究在HEK 293T细胞中进行实验。首先转染编码带His标签的ANDV N蛋白（ANDV His-N）的质粒。48小时后，共转染报告基因mRNA：cap-N-RNA-3‘UTR或将其3’UTR替换为poly(A)尾的对照mRNA（cap-N-RNA-poly(A)），同时共转染编码海肾荧光素酶（RLuc）的mRNA作为转染效率内参。6小时后裂解细胞，检测双荧光素酶活性，计算FLuc/RLuc比值作为相对翻译效率。通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）验证ANDV His-N蛋白的表达。
第三部分：ANDV N蛋白与宿主因子eIF4G的相互作用 研究通过两种方法验证ANDV N蛋白与翻译起始因子eIF4G在细胞内的相互作用。首先，在ANDV感染的Huh-7细胞中，使用针对ANDV N蛋白和内源性eIF4G的抗体进行邻近连接实验（Proximity Ligation Assay， PLA）。PLA信号（红色荧光点）表明两个蛋白在空间上非常接近（<40 nm），提示存在相互作用。其次，在无病毒感染的HEK 293T细胞中，进行双向免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation， Co-IP）实验。转染带有HA标签的ANDV N蛋白（ANDV HA-N）质粒或空载对照质粒，裂解细胞后，分别使用抗eIF4G抗体和抗HA抗体进行免疫沉淀，然后通过Western Blot检测沉淀物中是否存在另一方的蛋白，从而确认相互作用。
第四部分：鉴定结合ANDV smRNA 3‘UTR的宿主蛋白 为了寻找介导3’UTR功能的关键宿主因子，研究采用了gRNA亲和层析与纳米液相色谱-串联质谱（nano LC-MS/MS）联用的策略。首先，设计并体外转录了几种含有λ噬菌体boxB RNA元件（用于后续通过λN-GST融合蛋白进行亲和纯化）的“诱饵”RNA：1） 仅含3个boxB串联重复的对照RNA（3boxB）；2） 含有ANDV smRNA 5‘UTR和3个boxB的RNA（5’UTR-3boxB）；3） 含有5‘UTR、3个boxB和3’UTR的RNA（5‘UTR-3boxB-3’UTR）；4） 含有3个boxB和3‘UTR的RNA（3boxB-3’UTR）。使用Hela细胞提取物作为宿主蛋白库。为了富集特异性结合3‘UTR的蛋白，先将细胞提取物分别与过量的3boxB RNA或5’UTR-3boxB RNA孵育，去除非特异性RNA结合蛋白或结合5‘UTR的蛋白。然后将“澄清”后的提取物分别与不同的诱饵RNA孵育，通过λN-GST融合蛋白与谷胱甘肽琼脂糖珠捕获RNA-蛋白质复合物。洗脱结合的蛋白质，进行nano LC-MS/MS分析，鉴定蛋白质身份。将不同诱饵RNA结合蛋白的数据集进行比较分析，筛选出特异性或偏好性结合3’UTR的候选宿主蛋白。
第五部分：候选宿主蛋白MEX3A的功能验证 质谱分析结果将人类RNA结合蛋白MEX3A（hMEX3A）列为关键候选蛋白。hMEX3A含有KH结构域，已知可作为翻译调节因子。研究首先通过生物信息学分析，在ANDV smRNA 3‘UTR中识别出了多个潜在的MEX3A识别元件（MRE）。接着，在ANDV感染的Huh-7细胞中，通过RNA原位杂交-邻近连接实验（RISH-PLA），使用针对病毒正链小RNA（(+)srna）的探针和针对HA标签的抗体，证实了转染表达的hMEX3A-HA蛋白与病毒RNA在细胞内存在相互作用。为了验证hMEX3A对smRNA翻译的影响，在HEK 293T细胞中过表达hMEX3A-HA蛋白，然后转染cap-N-RNA-3‘UTR或cap-N-RNA-poly(A)报告基因mRNA，检测其翻译效率。为了证明hMEX3A的功能依赖于其RNA结合能力，研究人员通过定点突变构建了其KH结构域的RNA结合缺陷突变体（hMEX3A G240D）。首先在LS174T细胞系中通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验验证该突变体确实丧失了对已知靶标mRNA（eed mRNA）的结合能力。然后，在HEK 293T细胞中，比较野生型hMEX3A和G240D突变体对smRNA翻译的影响。此外，还设置了ANDV His-N蛋白与hMEX3A-HA（野生型或突变体）共表达的实验，以探究两者是否具有协同效应。通过RT-qPCR监测报告基因mRNA在细胞内的水平，确保翻译效率的变化不是由mRNA稳定性差异引起的。
第六部分：hMEX3A与eIF4G及ANDV N蛋白的相互作用网络 研究进一步探索了hMEX3A、eIF4G和ANDV N蛋白三者之间的关系。在ANDV感染或未感染的Huh-7细胞中，过表达hMEX3A-HA，使用PLA检测hMEX3A与内源性eIF4G之间、以及hMEX3A与ANDV N蛋白之间的相互作用。此外，在HEK 293T细胞中，通过Co-IP实验进一步确认这些相互作用。例如，用抗eIF4G抗体进行免疫沉淀，检测是否能同时拉下hMEX3A-HA和ANDV His-N；用抗HA抗体或抗His抗体进行免疫沉淀，检测是否能拉下eIF4G。
三、主要研究结果
1. ANDV N蛋白在体外以帽依赖方式刺激翻译，但不能替代eIF4G的功能。 体外翻译实验结果表明，重组ANDV GST-N蛋白能显著刺激cap-GLO-FLuc-poly(A)和cap-N-RNA-3‘UTR两种mRNA的翻译，最佳刺激效果在特定蛋白/RNA摩尔比下达到（图1）。当使用ACap替代5’帽时，ANDV N蛋白无法恢复翻译（图2A），证明其促进作用严格依赖于帽结构。更重要的是，当RRL中的eIF4G被FMDV L蛋白酶切割后，cap-N-RNA-3‘UTR的翻译被强烈抑制，而此时添加ANDV N蛋白并不能挽救翻译（图2C）。这表明，与SNV N蛋白不同，ANDV N蛋白在体外不能替代eIF4G的功能，eIF4G是ANDV smRNA翻译所必需的宿主因子。
2. 在细胞中，ANDV N蛋白通过3‘UTR依赖性方式增强smRNA翻译。 在HEK 293T细胞中，过表达ANDV His-N蛋白能剂量依赖性地增强cap-N-RNA-3‘UTR的翻译，但对cap-N-RNA-poly(A)的翻译无影响（图3）。这首次在细胞水平证实，ANDV N蛋白对smRNA翻译的促进作用依赖于其天然的3’UTR，而非通用的poly(A)尾，暗示3‘UTR可能招募了特定的辅助因子。
3. ANDV N蛋白在细胞中与eIF4G相互作用。 PLA和Co-IP实验均证实，在ANDV感染的细胞以及过表达ANDV N蛋白的非感染细胞中，ANDV N蛋白与翻译支架蛋白eIF4G存在直接的物理相互作用（图4）。这为ANDV N蛋白参与翻译起始复合体的组装提供了直接证据。
4. 鉴定出宿主RNA结合蛋白hMEX3A是ANDV smRNA 3‘UTR的结合蛋白。 通过gRNA亲和层析与质谱联用技术，从Hela细胞中鉴定出hMEX3A是一个特异性结合ANDV smRNA 3’UTR的蛋白（图5， S1数据）。生物信息学分析在3‘UTR中发现了多个MEX3A识别元件（MRE）（图6A）。RISH-PLA实验在ANDV感染的细胞中证实了hMEX3A与病毒正链小RNA的直接结合（图6C）。
5. hMEX3A以3‘UTR依赖性方式促进ANDV smRNA翻译，且其功能依赖于RNA结合能力。 在HEK 293T细胞中，过表达hMEX3A-HA能显著促进cap-N-RNA-3‘UTR的翻译，而对cap-N-RNA-poly(A)无影响（图7）。当使用RNA结合缺陷突变体hMEX3A G240D时，这种促进作用完全丧失（图8）。此外，hMEX3A与ANDV N蛋白共表达时，对smRNA翻译的刺激表现出叠加效应（图8F）。这些结果强有力地证明，hMEX3A通过结合smRNA的3’UTR，在翻译调控中扮演了积极的角色。
6. hMEX3A与eIF4G相互作用，但不与ANDV N蛋白直接作用。 PLA和Co-IP实验揭示了一个关键的相互作用网络：在ANDV感染或非感染的细胞中，hMEX3A都能与eIF4G发生相互作用（图9， 10， 11）。然而，尽管ANDV N蛋白和hMEX3A都与eIF4G结合，但两者之间并未检测到直接的相互作用（图9， 11）。这表明，ANDV N蛋白和hMEX3A可能是独立地通过eIF4G这个共同的“平台”被招募到翻译起始复合体中。
四、结论与意义
本研究得出结论：安第斯正汉坦病毒小mRNA（smRNA）的高效翻译是通过一个由病毒蛋白和宿主蛋白共同介导的、非共价的5‘-3’末端相互作用（闭合环）来实现的。具体机制是：病毒N蛋白结合在mRNA的5‘端区域（可能通过帽结构或附近序列），而宿主蛋白hMEX3A通过其KH结构域结合在smRNA 3’UTR的特定元件（MRE）上。尽管N蛋白和hMEX3A不直接相互作用，但它们都能独立地与翻译起始复合体的核心支架蛋白eIF4G结合。这种“三方汇聚”于eIF4G的模式，有效地将mRNA的5‘端和3’端拉近，形成了有利于翻译起始和/或核糖体回收的环化结构，从而克服了smRNA缺乏poly(A)尾的缺陷，优化了病毒蛋白的合成。
本研究的科学价值在于： 1. 揭示了ANDV独特的翻译机制：阐明了ANDV如何利用“病毒蛋白（N）+ 宿主适配蛋白（hMEX3A）+ 核心翻译因子（eIF4G）”的组合策略，实现其无poly(A)尾mRNA的高效翻译，拓展了对病毒劫持宿主翻译机器的认知。 2. 发现了新的病毒-宿主相互作用界面：首次鉴定出hMEX3A作为正汉坦病毒感染中重要的宿主因子，并明确了其通过结合病毒RNA 3‘UTR并连接eIF4G来促进翻译的功能，为理解RNA病毒与宿主细胞在翻译层面的博弈提供了新视角。 3. 明确了ANDV与SNV N蛋白的功能差异：研究发现ANDV N蛋白不能像SNV N蛋白那样完全替代eIF4F，提示即使同属正汉坦病毒，其成员也可能演化出不同的翻译调控策略，反映了病毒适应性的多样性。 4. 提出了潜在的新型抗病毒靶点：病毒N蛋白与hMEX3A都是ANDV高效复制所依赖的关键因素。针对N蛋白-eIF4G相互作用界面或hMEX3A-RNA结合活性的干预，可能成为未来开发特异性抗ANDV药物的新思路。
五、研究亮点
六、其他有价值的内容
研究还提出了几个有待进一步探索的有趣方向或假说，增加了文章的深度： 1. 与病毒复制场所的关联：文中提到hMEX3A和汉坦病毒的“抢帽”转录过程都定位于细胞质处理小体（P-bodies），推测在病毒mRNA合成之初，N蛋白和hMEX3A就可能被装载到新生mRNA上，为后续的高效翻译做好准备。 2. 多种复合物共存的可能性：作者推测在病毒感染细胞中，可能存在含有不同组合（如mRNA-N-eIF4G， mRNA-hMEX3A-eIF4G， 或mRNA-N-hMEX3A-eIF4G）的翻译起始复合物，它们可能竞争或协作，精细调控病毒蛋白的合成速率。 3. hMEX3A-eIF4G相互作用的普遍性意义：该相互作用在非感染细胞中也存在，提示其可能具有独立的细胞生物学功能，例如可能参与hMEX3A在肿瘤发生发展（其已知功能）中的调控，这为癌症研究提供了一个新的线索。