该研究由Sivaraman Kuppuswamy、Noah J. Watson、William Luke Ledford等学者共同完成，通讯作者为Augusta University医学院药理与毒理学系的Sangeetha Sukumari-Ramesh教授。研究成果于2025年发表在期刊《Neurobiology of Disease》上，论文标题为《Brain proteome changes after intracerebral hemorrhage in aged male and female mice》。
学术背景
脑出血（Intracerebral Hemorrhage, ICH）是卒中亚型之一，具有高死亡率和高致残率的特点。全球疾病负担研究显示，2019年全球有340万脑出血病例，导致280万人死亡。年龄是脑出血不良预后的独立预测因子，75-94岁人群的发病率比35-54岁人群高30倍。然而，目前针对老年群体的临床前研究匮乏，且脑出血在老年个体中的病理生理机制尚不明确。此外，尽管临床数据显示脑出血发病率无性别差异，但大多数 preclinical 研究仅使用年轻雄性动物模型，忽视了性别作为生物学变量的影响。因此，本研究旨在通过无标记定量蛋白质组学（label-free quantitative proteomics）和生物信息学方法，系统分析老年雄性和雌性小鼠脑出血后的蛋白质组变化，以揭示潜在的治疗靶点和病理机制。
研究流程
动物模型构建
- 研究对象：18-24月龄的C57BL/6雄性和雌性小鼠（美国国家衰老研究所提供），每组4-5只。
- 脑出血诱导：通过立体定位注射细菌胶原酶（0.04 U/0.5 μL）至左侧纹状体诱导脑出血，假手术组注射等量磷酸盐缓冲液（PBS）。术后3天处死小鼠，取同侧脑组织进行后续分析。
样本制备与质谱分析
- 样本处理：脑组织经PBS灌注后制备单细胞悬液，超声裂解后提取可溶性蛋白。
- 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）：采用Orbitrap Fusion质谱仪进行数据依赖性采集（DDA），通过Proteome Discoverer软件和SEQUEST HT算法比对UniProt小鼠数据库，肽段谱匹配（PSM）的假发现率（FDR）控制在1%以下。
- 定量分析：基于PSM计数进行半定量分析，标准化后比较脑出血组与假手术组的差异表达蛋白（DEPs）。
数据验证
- Western blot：验证14-3-3蛋白家族（泛抗体及γ亚型）、过氧化氢酶（catalase）、谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）的表达水平。
- 免疫组化：检测炎症标志物S100A9和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的分布与表达强度。
生物信息学分析
- 功能注释：使用PANTHER分类系统分析DEPs的分子功能、生物过程和蛋白类别。
- 通路分析：通过Ingenuity Pathway Analysis（IPA）筛选关键信号通路，如线粒体功能障碍、铁死亡（ferroptosis）、TLR信号调控等。
主要结果
差异表达蛋白谱
- 雄性小鼠：鉴定出133个DEPs（98个下调，35个上调），包括线粒体功能相关蛋白（如ATP合成酶亚基G、超氧化物歧化酶SOD1/SOD2）和炎症介质S100A9。
- 雌性小鼠：鉴定出315个DEPs（221个下调，94个上调），抗氧化蛋白（如GPX1）显著上调，而雄性组中SOD1/SOD2表达下降。
验证实验结果
- Western blot证实14-3-3蛋白家族在脑出血后普遍下调，而S100A9和GFAP表达上调。
- 免疫组化显示S100A9在血肿周围区域富集，提示其可能通过TLR4通路加剧神经炎症。
通路分析
- 共同通路：线粒体功能障碍在两组中均被识别为核心机制，涉及能量代谢紊乱和氧化应激。
- 性别差异：雌性小鼠表现出更强的抗氧化反应（如GPX1上调），而雄性小鼠更易发生氧化损伤（SOD1/SOD2下调）。
结论与意义
本研究首次系统揭示了老年脑出血模型的蛋白质组特征，提出线粒体功能障碍是脑出血急性期脑损伤的关键调控节点。性别特异性差异表明，雌性个体可能通过增强抗氧化防御减轻损伤，这为开发性别差异化治疗策略提供了依据。此外，S100A9和14-3-3蛋白的异常表达为未来功能研究和靶向干预指明了方向。
研究亮点
- 创新性方法：结合无标记定量蛋白质组学和生物信息学，全面解析老年脑出血的分子机制。
- 性别差异发现：首次报道脑出血后抗氧化反应的性别二态性，填补了老年雌性动物模型的研究空白。
- 转化价值：鉴定出S100A9和线粒体相关蛋白作为潜在治疗靶点，为临床干预提供新思路。
其他价值
研究数据已公开，可通过通讯作者获取原始质谱数据，支持后续假设驱动的功能验证（如基因敲除或药理学干预实验）。此外，实验设计中严格遵循3R原则，并通过Augusta University动物伦理委员会审查。