基于人诱导多能干细胞（iPSC）的4R tau病模型揭示tau蛋白传播的调控因子
第一作者与研究机构 本研究的通讯作者是来自威尔康奈尔医学院（Weill Cornell Medicine）的Shiaoching Gong和Li Gan。第一作者是Celeste Parra Bravo和Alice Maria Giani。该研究由来自威尔康奈尔医学院、加州大学旧金山分校、阿尔伯塔大学、哥德堡大学、宾夕法尼亚大学、梅奥诊所等多家机构的研究人员合作完成。这项原创性研究于2024年5月9日发表于顶级学术期刊《Cell》。
学术背景与研究目的 本研究的科学领域是神经退行性疾病，特别是tau蛋白病（Tauopathies）。这类疾病包括阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）以及多种额颞叶变性（frontotemporal lobar degeneration, FTLD）亚型，其特征是微管相关蛋白tau在神经元内形成异常聚集。Tau蛋白因其可变剪切，产生包含三个（3R）或四个（4R）微管结合域的不同亚型。其中，4R tau在诸如进行性核上性麻痹（progressive supranuclear palsy, PSP）、皮质基底节变性（corticobasal degeneration, CBD）等4R型tau蛋白病中起核心作用。
然而，深入理解tau蛋白病的机制面临重大挑战，部分原因在于缺乏合适的、能够准确模拟人类疾病病理过程的人源化模型。传统的人诱导多能干细胞（human iPSC）来源的神经元虽然被广泛应用，但它们通常只表达非常低的4R tau水平，这使得在体外精准建模4R型tau蛋白病变得困难。此外，在iPSC神经元中诱导出稳健的tau聚集也极具挑战性。因此，构建一个能够再现4R tau聚集、扩散（传播）及相关神经元功能障碍的可靠模型，对于揭示疾病机理和筛选潜在疗法至关重要。
本研究的主要目的是：1）建立一个稳定表达4R tau（并携带FTLD相关的P301S突变）的人iPSC来源的神经元模型；2）利用该模型模拟“种子”诱导的tau病理传播过程；3）揭示该过程中涉及的细胞学改变和分子通路；4）通过大规模CRISPRi（CRISPR干扰）筛选，系统性识别调控tau传播的遗传修饰因子。
详细研究流程 本研究包含一个复杂且多步骤的工作流程，主要包括模型构建、表型验证、病理机制探索以及大规模遗传筛选与验证。
1. 4R和4R-P301S人iPSC来源神经元的生成与表征 * 研究对象与方法：研究团队以能够快速分化为兴奋性神经元（i3神经元）的iPSC系为基础，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对MAPT（编码tau蛋白的基因）基因座进行改造。他们使用含有特定突变的供体质粒，促进tau蛋白外显子10的保留，从而构建了稳定表达4R tau的细胞系（4R-homo）。随后，又在该4R tau系中引入P301S突变，构建了表达4R-P301S tau的iPSC系（4R-P301S）。 * 样本与验证：获得了多个纯合子和杂合子克隆，并通过核型分析和多能性标志物染色验证了克隆的遗传稳定性。在诱导分化为神经元后，使用Western Blot和免疫荧光证实了4R tau或4R-P301S tau的特异性表达。结果显示，编辑后的神经元能够稳定且专一地表达目标tau亚型，并且4R-P301S神经元显示出比野生型4R神经元更高的磷酸化tau水平。RNA测序分析进一步揭示，P301S突变本身导致了超过2200个基因表达的改变，特别是下调了与细胞内运输和跨膜转运相关的基因，暗示这些神经元可能更容易出现蛋白质稳态失衡。
2. “种子”诱导的tau包涵体形成建模 * 处理方法：研究并未直接观察到神经元在长期培养后自发形成tau聚集。为了模拟病理性tau从“种子”开始的传播过程，研究者向培养的4R和4R-P301S神经元的培养基中添加了由tau蛋白的微管结合域片段（K18-P301L）形成的预制原纤维（Fibrils）。 * 表型分析：添加K18原纤维后，仅在4R-P301S神经元中，而非3R或野生型4R神经元中，观察到了由MC1抗体（一种识别病理性tau构象的抗体）标记的tau包涵体。这些包涵体对tau寡聚体和磷酸化tau的抗体也呈阳性。重要的是，包涵体的数量随着时间的推移（1-5周）逐渐增加，体现了“朊病毒样”的传播和扩增特性。 * 生化与结构验证：通过分级抽提（Triton X-100可溶和SDS可溶组分）的Western Blot分析证实，tau原纤维“种子”处理导致4R-P301S神经元中磷酸化tau从可溶组分向不可溶组分转移。透射电镜（TEM）观察到了神经元胞体内明显的tau原纤维结构。流式细胞术定量显示，在接种后21天和42天，携带MC1阳性包涵体的神经元比例显著且可重复性地增加。 * “种子”与“传播”的区分：一个关键实验使用荧光标记的K18原纤维来追踪被“种子”直接进入的神经元。结果表明，大多数含有tau包涵体的神经元并未检测到荧光标记的“种子”，这提示tau病理的扩增主要归因于细胞间或细胞内的“传播”机制，而非最初的“接种”事件本身。
3. 4R-P301S神经元模型的病理学与转录组学特征 * 细胞器异常：透射电镜分析揭示，在含有tau包涵体的4R-P301S神经元中，胞体和神经突起中积累了大量异常的、具有多层膜的结构，类似于多膜体（multilamellar bodies, MLB），这是溶酶体来源的细胞器，表明存在内体-溶酶体膜运输的功能障碍。 * 溶酶体融合功能验证：为了验证溶酶体功能紊乱在tau传播中的作用，研究者过表达了VAMP7蛋白的显性负性突变体（VAMP7dn）来抑制溶酶体膜融合。结果发现，抑制VAMP7功能后，KCl刺激诱导的tau分泌减少，但同时神经元内的MC1阳性tau包涵体面积显著增加。这表明内体-溶酶体系统的功能紊乱加剧了tau在细胞内的积累和传播。 * 转录组学关联：对形成包涵体的4R-P301S神经元（经K18处理）与未形成包涵体的4R神经元（经K18处理）进行批量RNA测序，发现了差异表达的基因集。进一步将结果与来自阿尔茨海默病患者死后脑组织单细胞RNA测序数据（比较含神经原纤维缠结（AT8+）与不含缠结（AT8-）的兴奋性神经元）进行重叠分析，发现了显著的重叠基因，这些基因富集在动作电位、钙离子转运、突触定位和囊泡运输等通路。这表明该体外模型与人类大脑中的tau病理在转录水平上具有相似性。
4. tau包涵体对神经元活性的影响及活性对传播的调控 * 创新性活细胞成像方法：为了在活体神经元中同时追踪tau病理和神经元功能，研究者创新性地利用CRISPR/Cas9在4R-P301S iPSC系的MAPT基因N端插入了HaloTag标签。结合HaloTag配体（JFX-549），可以在活细胞中可视化内源性tau的定位和聚集状态。 * 神经元活性记录：在表达HaloTag的4R-P301S神经元中，同时转导了新型基因编码的钙离子指示剂GCaMP8f。通过钙成像技术，研究者能够记录自发性钙瞬变和KCl诱发的钙反应。通过对比同一视野内具有可见tau包涵体（HaloTag信号聚集）和无明显包涵体的神经元，研究直接发现，含有tau包涵体的神经元其自发性钙瞬变的峰振幅和KCl诱发的钙反应峰值均显著降低。这首次在人类神经元中直接证明了tau聚集体会损害神经元活性。 * 神经元活性对传播的促进：相反地，研究者通过化学遗传学方法，利用抑制性DREADD受体（hM4Di）配合其配体CNO，长期抑制4R-P301S神经元的活性。结果发现，神经元活性的慢性抑制显著减少了K18“种子”诱导的tau包涵体的形成。这为“神经元活性促进tau传播”的假说提供了直接证据。
5. 大规模CRISPRi筛选识别tau传播的遗传修饰因子 * 筛选平台构建：利用该iPSC模型的规模化优势，研究者构建了稳定表达dCas9-KRAB（CRISPRi系统）的4R-P301S iPSC系，并将其分化为神经元。 * 筛选流程：将分化后的神经元转导一个定制的CRISPRi sgRNA文库，该文库靶向约1073个与tau病理生物学相关的基因，每个基因有5个sgRNA，并包含250个非靶向对照sgRNA。随后用K18 tau原纤维处理神经元以诱导tau传播。在接种后19天，通过固定、MC1抗体染色和流式细胞分选，将细胞分为MC1阳性（高tau包涵体）和MC1阴性（低/无tau包涵体）两群。通过下一代测序分析两个细胞群中每个sgRNA的频率变化，从而识别出能显著增加或减少MC1阳性细胞比例的基因。 * 筛选结果：筛选获得了超过500个tau传播的遗传修饰因子。其中，抑制后能减少tau包涵体的基因主要富集在线粒体相关通路（如复合物I、II、细胞色素c组分）和UFMylation级联通路（UBA5, UFM1, UFBP1, UFL1, UFC1）。UFMylation是一种类似于泛素化的翻译后修饰，与内质网相关蛋白降解等过程有关。而抑制后能增加tau包涵体的基因则高度富集在囊泡运输相关通路，包括内体-溶酶体生物发生与运输（如LAMTOR复合物、HOPS复合物亚基VPS16、VPS41）、高尔基体运输（如COG复合物）以及逆行运输复合体Retromer的关键亚基VPS29。
6. 关键修饰因子的功能验证 * VPS29验证：作为筛选出的最强促进tau传播的因子之一，研究者通过基因敲除在4R-P301S神经元中完全缺失了VPS29。结果表明，VPS29敲除的神经元在tau原纤维“接种”后，MC1阳性包涵体的神经元比例从亲本系的约20%急剧增加到超过80%-90%，强烈验证了Retromer复合物功能缺陷会显著加剧tau病理的传播。 * UFMylation通路验证：针对UFMylation通路，研究者使用shRNA在4R-P301S神经元中敲低了UBA5（E1酶）或UFM1（修饰蛋白本身）。流式细胞术和免疫荧光定量均显示，UBA5或UFM1的敲低显著减少了K18“种子”诱导的MC1阳性tau包涵体的形成。机制探索发现，敲低UBA5或UFM1降低了神经元内tau蛋白的稳态水平，这可能是其抑制tau传播的原因。进一步分析发现，在携带tau包涵体的4R-P301S神经元以及PSP、AD患者脑组织的缠结阳性神经元中，游离UFM1的水平均降低。 * 体内验证：研究者在一个tau传播的小鼠模型（PS19，表达人P301S tau）中进行了验证。向小鼠海马注射表达shUBA5的慢病毒以敲低UBA5，同时在另一侧海马注射K18 tau原纤维作为“种子”。结果发现，与对照组相比，UBA5敲低显著减少了tau病理从注射侧向对侧海马的扩散。这证明了靶向UFMylation通路在活体内也能抑制tau传播。
主要研究结果 本研究取得了系统性且相互印证的多层次结果： 1. 模型成功构建：成功建立了能够稳定表达4R或4R-P301S tau的人iPSC来源的神经元模型。该模型在tau原纤维“种子”存在下，能再现渐进性的、4R-P301S tau依赖性的胞内包涵体形成，并伴随原纤维结构和生化不溶性tau的产生。 2. 揭示了内体-溶酶体功能障碍与tau传播的关联：发现tau包涵体形成与多层膜体的异常积累相关，且功能上干扰溶酶体融合（VAMP7dn）会加剧tau积累。 3. 明确了tau病理与神经元功能间的双向作用：首次在活人神经元中直接证明tau包涵体会损害神经元活性（自发性及诱发反应降低）；同时，化学遗传学抑制神经元活性能够减少tau传播，证实了神经元活性是tau传播的驱动力。 4. 通过CRISPRi筛选系统揭示了新的调控网络：大规模筛选不仅确认了已知的线粒体、囊泡运输通路的关键作用，还首次将UFMylation通路和Retromer复合物亚基VPS29确立为tau传播的关键调控因子。 5. 关键靶点的功能与临床相关性验证：体外和体内实验均证实，抑制UFMylation（UBA5/UFM1）可减少tau传播，而抑制Retromer功能（VPS29敲除）则显著加剧传播。在人类PSP和AD患者脑组织中，UFMylation状态在缠结神经元中发生改变，提示了其在人类疾病中的潜在相关性。
结论与意义 本研究开发了一个强大、可扩展的人iPSC来源的4R tau蛋白病模型，该模型能够稳健地模拟“种子”诱导的tau病理传播过程，并再现了关键的疾病相关表型，包括内体-溶酶体功能障碍和神经元活性改变。利用该平台进行的CRISPRi功能基因组筛选，系统性地揭示了调控tau传播的遗传网络，并首次发现并验证了UFMylation通路是tau传播的一个关键新型调控因子，同时确认了Retromer复合物（通过VPS29）在其中的核心作用。
科学价值：这项研究为理解4R tau蛋白病的细胞和分子机制提供了前所未有的工具和见解。它揭示了tau传播不仅涉及细胞骨架蛋白的异常聚集，还与细胞内膜运输系统（内体-溶酶体、逆行运输）、能量代谢（线粒体）、翻译后修饰（UFMylation）以及神经元兴奋性等多个核心细胞生物学过程紧密交织。特别是UFMylation这一相对新颖的修饰通路在tau病理中的作用的发现，开辟了新的研究方向。
应用价值：该模型和筛选平台为后续药物靶点发现和药效评估提供了理想的“临床前”测试系统。识别出的关键基因和通路，尤其是UFMylation和Retromer相关组分，可能成为未来开发tau蛋白病治疗策略（如小分子抑制剂或激动剂）的新靶点。
研究亮点 1. 创新的疾病模型：成功克服了人iPSC神经元难以表达4R tau和形成稳健tau聚集的难题，构建了首个能够模拟“种子”诱导的4R tau传播的人神经元模型，且模型具备可扩展性，适合高通量研究。 2. 跨尺度、多模态研究方法：整合了基因编辑、活细胞成像（HaloTag+钙成像）、超微结构观察（TEM）、高通量功能基因组筛选（CRISPRi）、生化分析以及体内外验证，对tau病理进行了从分子到细胞再到动物模型的全面解析。 3. 开创性发现：首次利用CRISPRi在人类神经元模型中系统筛选tau传播的调控因子，并开创性地揭示了UFMylation通路在tau蛋白病中的关键作用，这一发现具有重要的原创性。 4. 机制深度：不仅描述了表型，还深入探讨了机制，如明确了神经元活性与tau传播的双向因果关系、内体-溶酶体/Retromer功能障碍在促进传播中的具体作用，以及UFMylation可能通过调节tau蛋白稳态水平来影响传播。 5. 临床关联性：研究结果与人类患者（PSP, AD）脑组织病理观察到的现象相符，增强了模型和发现的病理相关性及转化潜力。