非侵入性产前检测（NIPT）中胎儿DNA比例测定方法的比较研究

作者及机构
本研究由荷兰阿姆斯特丹自由大学医学中心临床遗传学系的Daphne M. van Beek、Roy Straver等团队主导，合作单位包括莱顿大学医学中心、阿姆斯特丹学术医学中心、代尔夫特理工大学等。研究成果于2017年发表在*Prenatal Diagnosis*期刊（DOI: 10.1002/pd.5079）。

学术背景
非侵入性产前检测（NIPT, Non-Invasive Prenatal Testing）通过分析孕妇血浆中的游离胎儿DNA（cfDNA, cell-free DNA）筛查胎儿染色体异常（如唐氏综合征）。检测的可靠性高度依赖于胎儿DNA比例（fetal fraction），若比例低于4%可能导致假阴性。然而，现有胎儿比例测定方法存在差异，且缺乏系统性比较。本研究旨在评估六种基于单端测序数据的胎儿比例测定方法，提出标准化质量控制流程。

研究流程与方法
1. 样本与数据收集
- 样本来源：654份孕妇血浆样本（279例女性胎儿，375例男性胎儿），来自荷兰TRIDENT研究项目，均获得伦理委员会批准。
- 测序数据：使用Illumina HiSeq2500平台进行51 bp单端测序，中位测序深度为1600万reads。数据比对至GRCh37参考基因组（BWA算法，零错配）。

1. 胎儿比例测定方法
   研究比较了六种方法，分为三类：

   • Y染色体依赖方法（仅适用于男性胎儿）：
     
     • DEFRAG：包含两种子方法：
       
     • *DEFRAG-A*：基于Y染色体reads比例与训练集（196样本）中纯男/女性DNA的归一化计算。
       
     • *DEFRAG-B*：仅使用Y染色体上男性特异性区域（排除与女性样本交叉映射的区段），通过GC校正提高准确性。
       
     • Bayindir法：同样包含两种子方法（Bayindir-A/B），原理类似DEFRAG，但采用50 kb基因组分箱和稳健中位数估计。
       
   • 性别无关方法（适用于所有胎儿）：
     
     • SeqFF：基于弹性网络和加权秩选择模型（WRSC），通过全基因组50 kb分箱的reads分布预测胎儿比例。
       
     • SANEFalcon：基于核小体定位特征，通过胎儿与母体DNA片段长度差异推算比例。
       

2. 质量控制与错误检测

   • 通过一次失败的测序实验（样本制备错误导致胎儿DNA丢失）验证各方法对低比例样本的敏感性。
     
   • 分析胎儿比例与孕妇体重指数（BMI）、孕周的相关性。
     

主要结果
1. 方法间一致性
- Y染色体依赖方法（DEFRAG-B与Bayindir-B）相关性最高（ρ>0.98），且对女性胎儿样本的预测值均为零，优于未排除交叉映射区域的DEFRAG-A/Bayindir-A。
- 性别无关方法（SeqFF与SANEFalcon）相关性较低（ρ=0.45），表明其准确性受限，但SeqFF略优。

1. 技术故障检测能力

   • SANEFalcon在检测低比例样本时表现最佳（男性样本61.1%，女性样本66.7%），因其对片段长度偏差敏感。
     
   • DEFRAG-B对男性样本的检测率为38.9%，优于Bayindir-B（27.8%）。
     

2. 临床变量影响

   • BMI与胎儿比例呈负相关（每增加1 kg/m²，比例降低0.42%），孕周呈正相关（每周增加0.23%），但相关性较弱（|ρ|<0.3），无法作为独立预测指标。
     

结论与建议
1. 标准化流程：推荐联合使用多种方法：
- SANEFalcon作为初筛工具检测胎儿DNA是否存在；
- DEFRAG-B用于男性胎儿比例定量（阈值≥4%）；
- SeqFF用于女性胎儿比例估算。
2. 技术优势：直接基于NGS数据测定胎儿比例可避免样本分选错误，提升检测效率。
3. 临床意义：为实验室提供了可整合至现有分析流程的开放获取工具（如DEFRAG已集成至WISECONDOR软件）。

研究亮点
1. 方法创新：DEFRAG-B通过Y染色体特异性区域优化，显著减少假阳性。
2. 全面比较：首次系统评估性别依赖与性别无关方法的性能差异。
3. 质量控制价值：揭示SANEFalcon在检测技术故障中的独特优势，弥补了传统Y染色体方法的局限性。

局限性与展望
研究样本量有限（654例），未来需扩大验证集。此外，未涵盖双端测序技术（如基于插入片段大小的方法），后续可扩展比较范围。

引用文献
- Straver R, et al. Prenat Diagn. 2016;36(7):614-621.
- Kim SK, et al. Prenat Diagn. 2015;35(8):810-815.