本研究由以色列特拉维夫大学分子细胞生物学与生物技术学院的Alexander Rosenberg、美国布朗大学分子微生物学与免疫学系的Iuliana V. Ene、以色列特拉维夫大学的Maayan Bibi、Shiri Zakin、Ella Shtifman Segal、以色列班古里昂大学的Naomi Ziv、以色列特拉维夫大学的Alon M. Dahan、巴西圣保罗联邦大学医学部的Arnaldo Lopes Colombo、美国布朗大学的Richard J. Bennett以及以色列特拉维夫大学的Judith Berman共同完成。该研究成果于2018年发表在《自然-通讯》（*Nature Communications*）期刊上。

本研究的学术背景聚焦于医学真菌学与抗真菌药物耐药性领域。念珠菌病，特别是由白色念珠菌（*Candida albicans*）引起的侵袭性感染，是临床上面临的重大挑战。氟康唑（Fluconazole, Flc）作为一种广泛使用的唑类抗真菌药物，其疗效常因病原体产生耐药性（resistance）而受限。然而，临床上还存在一种令人困惑的现象：即使体外药物敏感性测试（如最小抑菌浓度，Minimal Inhibitory Concentration, MIC）显示感染菌株对氟康唑敏感，部分患者的念珠菌血症感染仍然持续存在，无法被药物清除，即所谓“持续性念珠菌血症”（persistent candidemia）。传统的MIC测试旨在避免检测“拖尾生长”（trailing growth）现象，即菌株在高于MIC的药物浓度下仍有部分缓慢生长的现象。这种拖尾生长有时被称为“耐受性”（tolerance），但其临床意义和生物学机制尚不明确，且常与“耐药性”混为一谈。因此，本研究旨在系统地量化并定义抗真菌药物耐受性，阐明其与耐药性的区别，探究其分子机制，并评估其与临床治疗失败（即持续性感染）之间的关联。研究目标包括：1）开发量化耐受性的方法；2）揭示耐受性与耐药性在表型和机制上的差异；3）探索耐受性的细胞和分子基础；4）评估耐受性水平在动物感染模型中对药物疗效的影响；5）分析临床持续性念珠菌血症分离株的耐受性特征。

本研究的工作流程系统而详尽，主要包括以下几个步骤：首先是表型量化与分析，其次是机制探索，然后是体内疗效验证，最后是临床相关性分析。

在第一部分，研究者建立并采用了两种主要方法来量化药物反应：纸片扩散法（Disk Diffusion Assay, DDA）和肉汤微量稀释法（Broth Microdilution Assay, BMDA）。他们开发了一个名为“DiskImager”的图像分析工具，用于定量分析DDA结果。该工具不仅能测量抑菌圈半径（radius of inhibition, RAD，与MIC相关，反映敏感性/耐药性），更重要的是能计算抑菌圈内的生长分数（Fraction of Growth, FoG）。FoG定义为抑菌圈内曲线下面积与最大可能生长面积的比值，被用作衡量耐受性的关键指标。在BMDA中，他们除了计算24小时的MIC50（抑制50%生长的药物浓度），还计算了48小时的超MIC生长（Supra-MIC Growth, SMG），即高于MIC的各孔平均生长量（相对于无药生长）的归一化值。研究团队对219株临床来源的白色念珠菌分离株进行了大规模筛选。分析显示，FoG值范围很广（0.10-0.85），且与RAD值没有相关性，证明FoG（耐受性）与RAD/MIC（敏感性/耐药性）是独立的表型。同样，SMG与MIC也无相关性，但与FoG高度相关。此外，研究还发现，RAD值随纸片上药物浓度的增加而增大（浓度依赖性），而FoG值则在不同药物浓度下保持相对恒定（浓度非依赖性），这进一步强调了耐受性与经典耐药性机制的本质区别。为了确认这种耐受性表型不是由获得性耐药突变引起的，研究者从抑菌圈内或高于MIC的孔中取出细胞进行再培养，发现其后代与原始群体表现一致，表明这是一种稳定的、由群体异质性（phenotypic heterogeneity）导致的表现，而非遗传突变。

第二部分致力于揭示耐受性的细胞与分子机制。通过菌落形成单位（CFU）计数实验，研究者发现能在超MIC氟康唑浓度下形成菌落的细胞比例与FoG值高度相关，直接证明了FoG值代表了群体中能克服药物压力继续生长的亚群比例。利用延时显微技术和微菌落分析，他们观察到高FoG菌株有更大比例的细胞能在药物中持续分裂形成微菌落，且其菌落出现时间（Time of Appearance, ToA）的延迟短于低FoG菌株，说明高耐受性菌株的亚群能更有效地应对药物抑制。机制上，研究使用了一种荧光唑类探针（Flc-Cy5）通过流式细胞术监测细胞内药物水平。结果显示，细胞内Flc-Cy5的稳态水平（24小时）与FoG值呈显著负相关：高FoG菌株的细胞内药物累积更低。然而，药物外排速率（使用罗丹明6G示踪）与FoG无明确关联，表明耐受性相关的低药物水平是由复杂的因素决定的，包括摄取、外排以及其他未知的细胞内过程，而非简单的泵出增强。此外，研究测试了一系列佐剂药物（adjuvant drugs）与氟康唑联用的效果。这些佐剂包括热休克蛋白90（Hsp90）抑制剂（格尔德霉素、雷公藤红素）、钙调磷酸酶（calcineurin）抑制剂（环孢素A、FK506）、TOR抑制剂（雷帕霉素）、PKC抑制剂（星形孢菌素）以及抗精神病药氟非那嗪（Fluphenazine, Fnz）等。令人瞩目的是，大多数佐剂能显著降低甚至完全消除FoG（即清除耐受性），但对RAD/MIC（即耐药性）几乎没有影响。将这些佐剂与氟康唑联用，能使原本抑菌的氟康唑转变为杀菌效果。遗传学分析也支持了这一发现，缺失与钙调磷酸酶信号（如CNB1, CRZ1）、内体运输（VPS21）或麦角固醇合成调节（UPC2）相关的基因，主要影响FoG而非RAD。

第三部分通过动物感染模型验证耐受性的体内意义。研究者使用大蜡螟（*Galleria mellonella*）幼虫作为感染模型，比较了不同FoG水平菌株的致病性及对治疗的反应。他们使用了经过传代获得的、具有相似MIC但不同FoG水平的等基因菌株。实验发现，对于低FoG菌株，单用氟康唑与氟康唑+氟非那嗪（Fnz）联合疗法的效果相似。然而，对于高FoG菌株，单用氟康唑治疗效果不佳，而氟康唑+Fnz联合疗法则能显著提高幼虫存活率，延迟死亡。这证明，针对高耐受性菌株，靶向耐受性机制的联合疗法在体内具有显著优势，且这种疗效与菌株的耐受性水平直接相关。

第四部分直接探究了耐受性与临床结局的联系。研究者收集了两组临床分离株：一组是从氟康唑治疗下感染被迅速清除的患者中分离的“非持续性”（non-persistent, NP）分离株（7株）；另一组是从发生持续性念珠菌血症的患者中分离的系列分离株（12个患者系列，共多株）。所有分离株的MIC值均低于临床耐药折点（ μg/ml），表明它们对氟康唑“敏感”。关键发现是，与非持续性分离株相比，持续性念珠菌血症患者（尤其是治疗初期）的分离株表现出显著更高的FoG和SMG值。许多持续性分离株的FoG值超过0.5，意味着超过一半的细胞群体能在药物压力下缓慢生长。这一强有力的证据表明，耐受性水平（而非传统的MIC耐药性）与临床上氟康唑治疗失败、感染持续存在密切相关。

本研究的主要结论是：抗真菌药物耐受性是一种由群体中亚群细胞表现出的、在高于MIC浓度下缓慢生长的表型，它在机制和临床上均不同于经典的耐药性。耐受性具有亚群性、稳定性和浓度非依赖性，其分子基础涉及多种应激反应通路（如Hsp90、钙调磷酸酶等）和细胞内药物动力学。在临床意义上，高耐受性（高FoG）是预测氟康唑治疗失败和持续性念珠菌血症风险的一个重要且独立的指标。这挑战了当前临床实验室仅依赖MIC进行药敏测试和疗效预测的范式。

本研究的科学价值与应用价值重大。在科学上，它清晰界定并深入阐释了抗真菌“耐受性”这一独立概念，建立了其定量分析方法（FoG/SMG），并系统揭示了其细胞和分子机制，丰富了对抗真菌药物反应复杂性的理解。在应用上，研究提出了全新的临床预测指标：测量分离株的耐受性水平（FoG）可作为传统MIC测试的补充，用于更准确地预测患者对氟康唑治疗的反应，尤其是识别出那些MIC敏感但治疗可能失败的高风险感染。此外，研究为克服耐受性提供了明确的治疗策略：即使用靶向应激通路（如Hsp90、钙调磷酸酶）的佐剂药物与氟康唑联合治疗。这种联合疗法对高耐受性菌株特别有效，为临床应对棘手（recalcitrant）的持续性真菌感染提供了新的治疗方案思路，尤其在资源有限、唑类药物仍为主流的发展中国家具有重要意义。

本研究的亮点突出。首先，其最重要的发现是明确了耐受性与耐药性是两种截然不同的表型，并且首次提供了耐受性与临床持续性感染直接相关的强有力证据。其次，研究方法具有创新性：开发了DiskImager软件工具，实现了对纸片扩散法的定量化、高内涵分析，将传统的定性观察（有无抑菌圈、有无拖尾）转化为可精确测量的参数（RAD, FoG），这是技术上的重要进步。再者，研究整合了多层次的验证：从大规模体外表型筛选，到深入的细胞动力学和机制研究，再到体内动物模型验证，最后回归临床样本分析，逻辑链条完整，证据坚实。最后，研究对象的特殊性在于系统分析了来自持续性念珠菌血症患者的临床分离株系列，这使得其临床相关性结论非常具有说服力。

其他有价值的内容还包括：研究观察到高FoG菌株在某些条件下（如无药时）可能伴随毒力减弱，暗示耐受性可能存在适应性代价（fitness cost），这为理解耐受性在宿主环境中的进化提供了线索。此外，研究比较了不同念珠菌物种（如光滑念珠菌、热带念珠菌）的耐受性水平，提示耐受性现象可能在不同病原真菌中普遍存在但程度各异，拓宽了该研究发现的普适性意义。这项工作不仅革新了对抗真菌药物耐受性的认知，也为改善真菌感染的诊断策略和治疗方案提供了切实可行的新路径。