关于“Novel Aryl Alkamidazole Derivatives as Multifunctional Antifungal Inhibitors”的学术报告

主要作者及发表信息

本文题为“Novel Aryl Alkamidazole Derivatives as Multifunctional Antifungal Inhibitors: Design, Synthesis, and Biological Evaluation”，由Yating Liu、Wenxia Liu、Shuai Yu、Qingpeng Wang、Min Liu、Jun Han和Bin Sun等研究者完成。文章发表于 Journal of Medicinal Chemistry，2022年10月25日正式发表，文章DOI为：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.2c01451。这项研究由上述作者所在机构支持完成，文中对抗真菌领域的显著挑战及可能的创新解决方案进行了深入探讨。

研究背景及目的

背景：

真菌感染（尤其是侵袭性真菌感染，IFIs）的病例数近年来迅速增长，这与免疫力低下患者的增加、广谱抗生素的滥用等因素密切相关。此类感染会侵入宿主体内组织与器官，导致严重的病理反应。据统计，全球每年因真菌感染致死的病例数高达150万人，与结核病的死亡率接近。

目前临床上用于预防和治疗真菌感染的药物种类较少且效果有限，尤其是抗药性真菌的出现进一步增加了治疗难度。传统的CYP51（14α-脱甲基酶）抑制剂虽然取得了显著疗效，但其长期使用往往会引起毒副作用及导致真菌耐药性问题。而炎症在真菌感染中同样具有重要作用，致病真菌可通过花生四烯酸代谢途径快速诱导炎症因子表达，并通过外毒素抑制宿主免疫功能，加剧病情恶化。

目的：

因此，这项研究致力于设计和合成能够同时靶向CYP51抗真菌酶及炎症诱导酶COX-2（环氧合酶-2）的新型双靶点抑制剂。通过这种方法，不仅优化药物的抗真菌活性，还能减少传统联合用药的代谢负担和毒副作用，实现“1+1>2”的协同治疗效果。

研究流程及详细方法

本研究包含以下主要步骤：

1. 双靶点位分析及化合物设计
   研究首先分析了CYP51与COX-2这两种靶点蛋白的晶体结构（CYP51：PDB代码5TZ1；COX-2：PDB代码3RR3），明确其活性位点的构成与结合区域（CYP51：A2与B2；COX-2：A1与B1），进而结合靶蛋白的疏水性芳基结构设计骨架筛选策略。
   使用双靶点的片段库进行片段筛选及对接（Docking）模拟，筛选出高结合能力的重要结构片段，利用酰胺和酯化反应将骨架与不同的侧链连接生成了多种候选化合物。

2. 靶向化合物的合成与纯化 共合成三大系列新型靶向化合物，包括系列1（5a-1、5a-2等）、系列2（11a、11b等）和系列3（14b、14c等）。具体的化学合成路径包括多个步骤，如卤代苯的酰化反应、核取代、还原、以及与NSAIDs进行酯化或酰胺化反应。这些步骤保证了合成体系的高效性，同时针对结构中可能引发不良反应的基团（如NSAIDs中的羧基）进行合理的改性。

3. 体外抗真菌活性及抗药性测试 使用液体培养稀释法，测试化合物对五种代表性病原菌的MIC50值（最小抑菌浓度），包括Candida albicans（白色念珠菌）、Cryptococcus neoformans（新型隐球菌）等。同时测试化合物对耐氟康唑（Fluconazole-resistant Candida albicans）菌株的抑制能力。

4. 分子作用机理研究

   • 抑制活性分析：通过酶抑制实验分析化合物对CYP51及COX-2的IC50值，并结合分子对接模拟确认双靶点的结合构象和结合能量。
   • 细胞水平实验：利用荧光染料跟踪化合物进入真菌细胞后的分布区域，分析其诱导ROS（活性氧物质）聚集、线粒体功能受损以及凋亡的状况。
   • 形态观察：通过透射电子显微镜观察化合物处理后真菌细胞壁完整性的变化。
   • GC-MS检测：采用气相色谱-质谱联用仪检测化合物作用后真菌细胞中甾醇含量的变化，以确定其对CYP51的抑制作用。

5. 体内疗效评价 在真菌感染的小鼠模型中，通过静脉注射测试化合物的抗真菌治疗效果、低毒性、及对炎症因子表达的抑制效果。同时观察其改善宿主免疫功能的能力，如PD-L1等免疫抑制分子的表达变化。

研究结果及支持数据

1. 抗真菌活性 多种化合物对Candida spp.表现出优异的抑菌能力，部分化合物的MIC50在0.125-2.0 µg/mL范围内。化合物14b-1-2和14c-2-1在耐氟康唑菌株上的活性亦显著高于阳性对照药物。

2. 双靶点抑制性能 优化后化合物（如14c-2-1）的CYP51和COX-2的IC50值分别达0.16 µM和1.93 µM，显示出显著的双靶点结合能力。

3. 诱导ROS聚集及细胞凋亡 荧光实验表明，化合物能快速诱导真菌细胞ROS水平增加数倍，破坏线粒体内膜电位，从而引发凋亡。

4. 细胞壁完整性与甾醇含量 TEM结果表明，化合物可以显著削弱真菌细胞壁的厚度并诱发细胞形态学改变。此外，GC-MS分析结果显示化合物能够显著减少真菌细胞中的麦角固醇（Ergosterol）含量。

5. 炎症和免疫调控 在体内实验中，化合物显著降低了炎症诱导因子（如COX-2、NF-κBp65）以及免疫抑制分子PD-L1的表达，同时增强了CD3+和CD8+T细胞的活性。

研究的结论与意义

本研究通过对双靶点CYP51/COX-2的系统分析，设计并合成了一系列新型化合物，解决了传统抗真菌药物单靶点不足与联合用药毒副作用等问题。这些化合物在抗真菌活性、抗药性真菌抑制、炎症处理及免疫提升上展现出广阔的应用前景。其科学意义主要体现在以下几点： - 提供了抗真菌药物优化的新思路及策略； - 突出了双靶点协同性在药物设计中的重要价值。

研究亮点

1. 方法学创新：首次结合COX-2和CYP51进行双靶点设计。
2. 活性化合物优异：化合物14c-2-1展现出特别优异的广谱活性。
3. 应用潜力高：在体内表现出低毒性、快速缓解感染、防控炎症与增强免疫的多效功能。

研究为抗真菌领域提供了重要模型参考并为后续的药物研发拓宽了方向。