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本文介绍了一项由Maurizio Piergiovanni、Silvia Carlin、Cesare Lotti、Urska Vrhovsek和Fulvio Mattivi等人完成的研究。第一作者和研究团队主要来自意大利Edmund Mach基金会研究与创新中心以及特伦托大学农业食品环境中心。该研究于2023年2月27日在线发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》，并在2024年第72卷第1995至2007页正式刊出。

这项研究属于葡萄酒分析化学领域，聚焦于挥发性羰基化合物（volatile carbonyl compounds, VCCs）的定量检测方法开发及其在葡萄酒陈酿评估中的应用。羰基化合物是葡萄酒中一类重要的香气活性物质，包括直链醛、斯特雷克醛（Strecker aldehydes）、不饱和醛、酮类和呋喃类化合物等。它们的浓度通常在纳克每升到微克每升级别，但由于其极低的感觉阈值，对葡萄酒的香气特征有显著影响。部分羰基化合物带来令人愉悦的香草、焦糖、蜂蜜、杏仁等香气，而另一些则在氧化条件下积累，产生酵母味、氧化味等不良风味。因此，准确测定葡萄酒中羰基化合物的含量对于判断发酵是否完全、酿造工艺是否恰当以及装瓶和储存条件是否合适具有重要价值。然而，文献中已有的方法大多依赖固相萃取（solid phase extraction, SPE）和衍生化步骤，操作繁琐且难以实现自动化，不符合绿色分析化学的原则。为此，本研究的主要目标是开发并验证一种绿色、稳健、高通量的顶空固相微萃取-气相色谱-串联质谱（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-tandem mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS/MS）方法，用于同时定量葡萄酒中的44种羰基化合物，并将其应用于加速陈酿实验中羰基化合物变化规律的研究。

研究的工作流程可以分为方法优化、方法验证和应用实验三个主要阶段。在方法优化阶段，研究团队选择了基于PFBHA（O-(2,3,4,5,6-五氟苄基)羟胺盐酸盐）的溶液内衍生化策略，并通过CTC-PAL3自动进样器实现了全自动化操作。样品首先从2 mL小瓶转移到20 mL顶空瓶中，加入内标溶液和PFBHA衍生化溶液，然后在45°C搅拌条件下进行衍生化反应。衍生化完成后，将样品瓶转移至40°C搅拌器中，用65 μm PDMS/DVB纤维萃取20分钟，最后在250°C进样口解吸4分钟。为了实现最优的衍生化效率，研究专门考察了衍生化时间的影响。实验选用了两瓶具有不同二氧化硫含量的白葡萄酒，分别在5、10、15、20、30、60和120分钟的衍生化时间下进行分析，并设置了添加20 mg/L二氧化硫和添加40 mg/L乙醛的对照处理。结果表明，小分子化合物在10分钟左右达到最大响应，而较大分子量的化合物对时间依赖性较低，10分钟是所有分析物的最佳折中条件。二氧化硫和乙醛的加入对衍生化效率没有显著影响，说明40 g/L的PFBHA浓度足以将反应平衡强烈推向衍生化产物方向，能够同时测定游离态和结合态的羰基化合物。在色谱分离方面，研究采用Restek Rxi Sil MS色谱柱，程序升温从40°C开始，经过多步升温至250°C，总运行时间约55分钟。质谱采用多反应监测（multiple reaction monitoring, MRM）模式，以提高选择性和灵敏度。方法验证阶段主要包括线性、检出限、重复性和回收率评估。线性范围从0.05 μg/L到250 μg/L，对于呋喃类化合物扩展到5000 μg/L。所有化合物的决定系数R²均大于0.99。定量限（limit of quantification, LOQ）设定为0.05 μg/L，信噪比大于10。日内重复性在5 μg/L水平下大多数化合物的相对标准偏差低于20%，在50 μg/L水平下精密度更好。日间重复性在20%到30%之间。回收率实验使用了Müller-Thurgau白葡萄酒和Sfursat红葡萄酒两种基质，加标浓度为5 μg/L，大多数化合物的回收率在100±30%范围内。此外，研究还在四个强化葡萄酒样品（雪利酒、马德拉酒、马沙拉酒和波特酒）中进行了方法适用性检验，获得了与文献报道一致的结果。

在应用实验阶段，研究团队使用该方法研究了白葡萄酒和红葡萄酒在加速陈酿过程中羰基化合物的演变规律。研究对象包括7个Gewürztraminer白葡萄酒样品和7个Teroldego红葡萄酒样品，均来自意大利Trentino-Alto Adige产区2019年份。加速陈酿程序参照Pereira等人提出的方法，将葡萄酒分装到100 mL玻璃瓶中，在50°C下储存5周，分别在第0周、第2.5周和第5周取样分析。首先进行的预实验考察了顶空体积的影响，将样品分别装满、留5 mL、50 mL和75 mL顶空，结果显示15种羰基化合物在不同顶空体积下没有显著变化，而直链醛、斯特雷克醛和呋喃类化合物在50 mL和75 mL顶空条件下积累最为显著。后续正式实验采用0.7 mL顶空模拟真实瓶储条件。结果显示，Gewürztraminer白葡萄酒中，2-丁酮、3-甲基-2-丁酮、丙醛、丁醛、戊醛、己醛、甲硫基丙醛、2-糠醛、5-甲基-2-糠醛、2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛和苯乙醛等化合物的含量在陈酿过程中显著增加。呋喃类化合物来源于碳水化合物的脱水和环化反应，其含量与褐变现象密切相关，可以作为氧化葡萄酒陈酿程度的指标。斯特雷克醛则主要通过氨基酸脱羧和脱氨反应生成，其积累与葡萄酒中活性多酚的含量呈负相关。主成分分析显示，第一主成分解释了59.3%的方差，样品在得分图中沿第一主成分清晰地分为三个对应于不同陈酿时间点的组。Teroldego红葡萄酒中，除了与白葡萄酒相似的直链醛和斯特雷克醛增加外，还观察到E-2-丁烯醛、E-2-戊烯醛、E-2-己烯醛、4-(甲硫基)-2-丁酮、庚醛和苯甲醛等化合物的显著变化。值得注意的是，戊醛、己醛和庚醛在红葡萄酒中呈现非线性行为，在陈酿初期积累，随后又下降，这可能是由于醛类在高温和压力条件下参与酯化反应，或者与红葡萄酒中丰富的类黄酮发生亲电加成反应所致。主成分分析同样将Teroldego样品按陈酿时间分为三个组，但沿第二主成分的分布更广，反映了红葡萄酒中羰基化合物变化的复杂性。

研究的主要结论是：所开发的HS-SPME-GC-MS/MS方法具有高灵敏度、高选择性、良好的精密度和回收率，且实现了全自动化操作和溶剂使用的最小化，符合绿色分析化学原则。该方法成功应用于加速陈酿葡萄酒中44种羰基化合物的同时定量，揭示了呋喃类化合物、直链醛和斯特雷克醛是陈酿过程中变化最显著的化合物类别。白葡萄酒和红葡萄酒在部分羰基化合物的演变行为上存在差异，这与基质中多酚含量和二氧化硫水平的差异有关。该研究为葡萄酒行业提供了一种可用于质量控制的新型分析工具，可用于监测葡萄酒在整个生命周期中的羰基化合物变化，评估发酵完整性、陈酿状态和储存条件的适宜性。

本文的亮点包括：第一，建立了一种全自动化的HS-SPME-GC-MS/MS方法，可同时定量44种羰基化合物，显著提高了分析通量和重复性；第二，通过使用高浓度PFBHA衍生化试剂，仅需10分钟即可完成衍生化反应，且能够同时测定游离态和结合态羰基化合物；第三，方法完全避免了有机溶剂的使用，样品前处理过程由自动进样器完成，实现了绿色分析的目标；第四，将方法成功应用于加速陈酿实验，系统揭示了两类不同葡萄酒中羰基化合物的演变规律，为葡萄酒陈酿化学研究提供了可靠的数据支持。