本文属于类型a，即单篇原始研究论文。以下为针对该研究的学术报告。

一、研究作者、机构与发表信息

本研究由车梦莹、袁玲、闵姣、许多杰、鲁豆豆、刘文静、王凯丽、王艳艳、南一等人完成。主要研究机构包括宁夏医科大学少数民族医药现代化教育部重点实验室、宁夏医科大学药学院、宁夏医科大学中医学院、宁夏医科大学临床医学院以及银川市中医医院内分泌科。通讯作者为南一教授，来自宁夏医科大学少数民族医药现代化教育部重点实验室。该研究于2024年3月15日发表在《World Journal of Diabetes》第15卷第3期，文献DOI为10.4239/wjd.v15.i3.530。

二、研究背景与目的

糖尿病肾病（diabetic kidney disease, DKD）是糖尿病常见的严重并发症之一，也是终末期肾病的主要病因之一。据国际糖尿病联盟流行病学数据，全球糖尿病患病率约为9.3%，其中20%至40%的患者会发展为DKD。目前西医治疗DKD主要依靠控制血糖和改善肾功能，常用药物包括血管紧张素转换酶抑制剂和磺脲类药物，但疗效有限，难以有效延缓疾病进展。因此，寻找疗效确切且副作用小的药物成为DKD治疗领域的重要需求。

中医药在DKD治疗中经多年临床应用已显示出一定疗效，但其具体分子机制尚不明确。甘松—大黄药对（Nardostachyos Radix et Rhizoma-Rhubarb drug pair, NRDP）是本研究关注的中药组合。甘松具有抗炎、抗凋亡、抗氧化应激及调节血糖代谢等作用，大黄则可通过多种机制延缓DKD进展，包括降低尿毒症毒素水平、调节肠道菌群、延缓肾间质纤维化等。然而，NRDP治疗DKD的具体药物靶点和分子机制尚未被阐明。

本研究旨在通过网络药理学结合分子对接技术，探讨NRDP治疗DKD的潜在分子机制，并通过体外细胞实验对预测结果进行初步验证，以期为DKD的中医药治疗提供新的思路和方法。

三、研究流程与实验方法

本研究采用“网络药理学预测—分子对接验证—体外细胞实验验证”的总体策略，主要分为以下几个步骤。

第一步，获取NRDP的活性成分及其靶点。研究利用TCMSP数据库检索甘松和大黄的活性成分，筛选标准为口服利用度不低于30%且类药性不低于0.18。共获得15个活性成分，其中甘松5个、大黄10个。随后利用UniProt数据库将活性成分对应靶点转换为基因名称，去除重复后共获得85个NRDP靶点，其中甘松靶点43个，大黄靶点69个。

第二步，获取DKD疾病相关靶点。在GeneCards、OMIM和TTD数据库中，以“diabetic kidney diseases”和“diabetic nephropathy”为关键词进行检索，共筛选得到7046个DKD相关靶点。利用Venny 2.1.0平台将NRDP靶点与DKD靶点取交集，获得73个药物—疾病共同靶点。

第三步，构建“药物—成分—靶点—疾病”网络。通过Cytoscape 3.9.0软件将NRDP活性成分、共同靶点及疾病进行可视化网络构建，展示NRDP通过多成分、多靶点发挥治疗DKD的作用特征。

第四步，构建蛋白—蛋白互作（protein-protein interaction, PPI）网络。将73个共同靶点导入STRING 11.5数据库，物种设定为“智人”，最小互作阈值设为最高置信度（>0.9），获得PPI网络。利用Cytoscape中Network Analyzer插件分析网络拓扑特征，根据节点度值筛选核心靶点。结果显示核心靶点包括TP53、STAT3、HSP90AA1、JUN、RELA、ESR1、CCND1、MYC、CDKN1A、NR3C1和CDK1。同时，将与PPI靶点相关的NRDP活性成分进行网络分析，得到芦荟大黄素、隐丹参酮、尤帕亭、大黄酸、金合欢素等7个主要活性成分。

第五步，基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析。将交集靶点导入DAVID数据库，以P值小于0.01和错误发现率小于0.01为筛选条件。GO富集分析共获得1528条生物学过程条目、107条细胞组分条目和115条分子功能条目，主要涉及对含氧化合物的反应、对有机环状化合物的反应、细胞对化学刺激的反应、膜筏、胞质部分、酶结合、蛋白结构域特异性结合、转录因子活性等。KEGG通路富集分析共获得111条信号通路，其中前20条通路包括癌症通路、PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路以及凋亡信号通路等。研究确定AGE-RAGE信号通路为核心通路，并进一步构建了NRDP活性成分与该通路关键靶点的网络关系图。

第六步，分子对接验证。从PubChem数据库下载NRDP活性成分的mol2结构，从PDB数据库下载核心靶点蛋白的3D结构，利用PyMOL 2.4.0软件去除水分子和小分子配体，使用AutoDock 1.5.7软件进行加氢和分子对接。核心靶点蛋白分别为ESR1（PDB ID: 6CHW）、RELA（3CBQ）、TP53（3DCY）、HSP90AA1（1BYQ）、JUN（2P33）、CCND1（2VTH）和STAT3（6NJS）。结合能评价标准为：小于-4.25 kcal/mol为结合活性较低，小于-5.0 kcal/mol为结合活性良好，小于-7.0 kcal/mol为结合活性强。结果显示10个活性成分与7个核心靶点蛋白的结合能均小于-5.0 kcal/mol，其中STAT3与(-)-儿茶素的结合能最低，为-9.3 kcal/mol。

第七步，体外细胞实验验证。实验使用小鼠肾小管上皮细胞系TCMK-1。首先采用CCK-8法检测不同浓度NRDP对高糖诱导TCMK-1细胞活力的影响，并用GraphPad Prism 8.0.2拟合半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC50）。实验分组包括对照组（完全培养基）、模型组（60 mmol/L高糖培养基）及不同浓度NRDP干预组。通过流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡，实验分为对照组、模型组、NRDP低剂量组（4 mg/mL）、中剂量组（7 mg/mL）和高剂量组（10 mg/mL）。Western blot检测STAT3、p-STAT3、Bax、Bcl-2、caspase9和caspase3蛋白表达，实验分组为对照组、模型组和NRDP中剂量组（7 mg/mL）。数据分析采用GraphPad Prism 8.0.2软件，组间比较采用单因素方差分析，方差齐性用SNK检验，方差不齐用Tamhane’s T检验，P值小于0.05认为差异有统计学意义。

四、主要研究结果

网络药理学结果显示，NRDP共有10个有效活性成分和85个靶点，涉及111条疾病相关信号通路。KEGG富集分析确定AGE-RAGE信号通路为核心通路。分子对接显示各活性成分与核心靶点之间均具有良好的结合活性。

在细胞活力实验中，模型组TCMK-1细胞活力较对照组显著升高（P < 0.01），而NRDP干预后细胞活力较模型组显著下降（P < 0.01），且呈浓度依赖性，即NRDP浓度越高，细胞活力下降越明显。NRDP的IC50值为7.84 mg/mL，据此确定低、中、高剂量分别为4、7、10 mg/mL。

细胞周期实验显示，对照组G0/G1期细胞比例为60.1%±0.70，模型组为40.23%±1.07，模型组较对照组显著降低（P < 0.01）。NRDP干预后G0/G1期细胞比例升高，低、中、高剂量组分别为45.55%±1.23、48.93%±0.75、61.04%±1.66，且S期细胞比例下降，差异均有统计学意义（P < 0.01）。这表明NRDP可将TCMK-1细胞阻滞在G0/G1期。

细胞凋亡实验显示，对照组凋亡率为7.17%±0.168，模型组为19.32%±1.975，模型组凋亡率显著升高（P < 0.01）。NRDP干预后凋亡率显著下降，低、中、高剂量组分别为15.55%±0.257、12.80%±0.773、10.18%±0.523，且呈浓度依赖性，即NRDP浓度越高，凋亡率下降越明显（P < 0.01）。

Western blot结果显示，与对照组相比，模型组p-STAT3、Bax、caspase3和caspase9蛋白表达及Bax/Bcl-2、p-STAT3/STAT3比值均升高（P < 0.01），而Bcl-2和STAT3蛋白表达降低（P < 0.01）。NRDP干预后，p-STAT3、Bax、caspase3和caspase9蛋白表达及Bax/Bcl-2、p-STAT3/STAT3比值均降低（P < 0.01或P < 0.05），Bcl-2和STAT3蛋白表达升高（P < 0.01）。

这些结果表明，NRDP可通过调控AGE-RAGE信号通路相关蛋白的表达，抑制高糖诱导的TCMK-1细胞活力，将细胞阻滞在G0/G1期，并减少细胞凋亡，从而保护肾小管上皮细胞免受高糖损伤。

五、研究结论与价值

本研究得出结论：NRDP可能通过上调Bcl-2和STAT3蛋白表达，下调Bax、caspase3和caspase9蛋白表达，从而激活AGE-RAGE信号通路，抑制TCMK-1细胞活力，减少细胞凋亡，并将细胞阻滞在G0/G1期，以保护肾小管上皮细胞免受高糖损伤。该研究为甘松—大黄药对治疗DKD提供了分子层面的实验依据，同时也为中药复方治疗DKD的新药研发提供了新的思路和方法。研究提示中药复方可通过多成分、多靶点、多通路的方式发挥肾脏保护作用，具有潜在的临床应用价值。

六、研究亮点

本研究的亮点在于将网络药理学、分子对接和体外细胞实验验证相结合，系统性地探讨了NRDP治疗DKD的潜在机制。首先，研究利用多个数据库构建了药物—疾病靶点网络，揭示了NRDP多成分、多靶点的作用特征。其次，通过KEGG富集分析确定AGE-RAGE信号通路为核心通路，并通过分子对接验证了活性成分与核心靶点的结合能力。最后，通过细胞实验证实了NRDP对高糖诱导的肾小管上皮细胞具有保护作用，并进一步探讨了其通过调控凋亡相关蛋白表达发挥作用的分子机制。此外，本研究聚焦于甘松—大黄这一特定药对，为其在DKD治疗中的应用提供了直接的实验证据，具有一定的创新性和临床应用前景。

七、其他有价值的内容

研究团队在讨论部分指出，AGEs与其受体RAGE结合后可通过激活JAK/STAT等下游信号通路，促进炎症反应和细胞凋亡，从而加剧DKD进展。本研究观察到NRDP干预后Bax、caspase3和caspase9表达下调，Bcl-2表达上调，以及p-STAT3/STAT3比值降低，提示NRDP可能通过抑制AGE-RAGE信号通路介导的凋亡级联反应来保护肾小管上皮细胞。此外，研究还指出，由于经费限制，本研究仅进行了体外细胞实验，未来计划通过高通量组学手段和体内动物实验进一步验证NRDP治疗DKD的具体机制，并鉴定其入血活性成分，以期为DKD的临床治疗提供更安全有效的方法。