这是一篇关于实验性脑卒中后大脑和血液单细胞转录组学研究的学术报告。
作者与发表信息 本研究的主要作者为Lidia Garcia-Bonilla和Josef Anrather，他们来自美国威尔康奈尔医学院（Weill Cornell Medicine）的Feil Family Brain and Mind Research Institute。该研究于2024年1月4日在线发表于《Nature Immunology》期刊（第25卷，357–370页）。
研究背景与目标 脑卒中（俗称“中风”）是全球致死和致残的主要原因之一。当缺血性卒中发生时，大脑血管堵塞导致脑组织损伤，随后会触发一个强大且复杂的炎症反应。这个炎症过程涉及外周血白细胞（peripheral leukocytes）的浸润和脑内常驻免疫细胞（brain resident cells）的激活，它们共同参与了急性期的组织损伤和亚急性期的组织修复。然而，这些免疫细胞在损伤不同阶段的动态变化、功能多样性和异质性（heterogeneity）仍然不清楚。以往的研究方法无法在单个细胞水平上精确解析这种复杂性。
为了解决这一局限性，研究团队利用单细胞RNA测序技术（scRNA-seq），对小鼠实验性卒中后的大脑和血液细胞进行了高分辨率的转录组学研究。主要目标包括：第一，描绘卒中后急性期（2天）和亚急性期（14天）大脑和血液中免疫细胞及内皮细胞（endothelial cells, ECs）的转录图谱；第二，探究脑内浸润细胞与相应血液中循环细胞的转录组差异，从而评估细胞分化是发生在外周还是进入大脑之后；第三，比较年轻与年老小鼠卒中后细胞反应的差异；第四，将小鼠血液白细胞的转录组变化与已发表的人类卒中数据进行比较，评估其跨物种的保守性。
详细研究方法与工作流程 本研究的工作流程分为几个关键步骤。 第一步是动物模型和脑卒中诱导。研究者使用了年轻的成年雄性C57BL/6J小鼠（8-12周龄）作为主要研究对象，并构建了短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）模型来模拟缺血性卒中。分别在假手术（sham，即对照组）、卒中后2天（d02，代表急性期）和卒中后14天（d14，代表亚急性/恢复期）三个时间点收集样本。为了研究衰老的影响，他们还纳入了老年（17-20个月龄）的雄性和雌性小鼠。此外，为了明确区分脑内常驻免疫细胞和从血液中招募的细胞，研究者构建了一种关键的遗传工具小鼠：通过他莫昔芬（tamoxifen）诱导的Cx3cr1-CreER;R26-tdTomato转基因小鼠。在该小鼠中，脑内长期存在的髓系细胞（如小胶质细胞和边界相关巨噬细胞）会被永久标记上红色荧光蛋白tdTomato（td+），而新浸润的单核细胞来源细胞则为td-，从而实现了谱系追踪。
第二步是细胞分离、分选与测序。在相应时间点，研究人员快速分离了小鼠的大脑和外周血单核细胞。对于脑组织，他们制备了单细胞悬液，并通过流式细胞术（flow cytometry）分选了CD45hi的免疫细胞、小胶质细胞和内皮细胞。对于血液，则分离了总白细胞。之后，他们使用基于微滴的单细胞RNA测序平台，对来自年轻雄性小鼠的43,269个脑细胞进行了大规模测序。
第三步是数据分析流程。这是研究的核心部分。测序数据通过标准的生物信息学流程处理，包括质量控制、比对和表达定量。随后，研究人员采用无监督聚类（unsupervised clustering）和统一流形逼近与投影（UMAP）算法对细胞进行降维和可视化。通过分析已知的标记基因，他们识别并注释了13个主要的脑细胞集群和9个外周血细胞集群。针对感兴趣的特定细胞亚群，如小胶质细胞（microglia）、边界相关巨噬细胞（border-associated macrophages, BAMs）、髓系来源细胞（myeloid-derived cells, MDCs）和粒细胞（granulocytes），研究者们进行了“亚聚类”分析，以揭示更精细的细胞状态。一个关键的高级分析方法是“伪时间轨迹推断”（pseudotime trajectory inference），该方法可以从转录组数据中预测细胞的分化顺序和发展路径。例如，他们利用此方法推断了血液单核细胞如何逐步分化成脑内巨噬细胞，以及粒细胞是否在脑内进行分化。为了验证测序数据，他们使用了RNAscope荧光原位杂交联合免疫荧光（FISH-IF）技术在组织切片上验证关键基因（如Cst7， Igf1， Cxcl10， Lrg1， Arg1）的表达和空间定位。最后，为了进行跨物种比较，他们运用了数字解卷积（digital deconvolution）方法，将人类大体积RNA-seq数据和小鼠单细胞数据调整到相似的细胞组成谱，随后进行了KEGG通路富集分析。
主要研究结果 该研究获得了以下一系列重要发现。 第一，小胶质细胞在不同阶段呈现出截然不同的转录状态。这是本研究中变化最剧烈的脑常驻细胞群。分析发现了8个小胶质细胞亚群。在对照组中，小胶质细胞主要表现为稳态特征（mg1， mg2）。卒中后2天，出现了两个新的主要亚群：mg4亚群高表达与清除损伤细胞相关的基因（如Spp1， Msr1）；mg5亚群则高表达增殖相关基因（如Top2a， Mki67），表明小胶质细胞在急性期有强烈的增殖反应。卒中后14天，主要亚群转变为mg3、mg6和mg7。这些亚群的特征与前人报道的“疾病相关小胶质细胞”（DAM）和“神经退行性疾病相关小胶质细胞”特征相似，高表达Apoe， Cst7， Clec7a， Igf1等基因。伪时间轨迹分析显示，小胶质细胞从稳态状态可以直接进入d02或d14的状态，但没有从d02到d14的分化轨迹，提示它们的状态转变并非一个连续的线性过程。组织学验证发现，d02时缺血核心区小胶质细胞数量显著减少，但周边区出现了增殖（Ki67+）的小胶质细胞；到d14时，td+小胶质细胞重新占据了缺血区域，并表达Igf1和Cxcl10等因子。
第二，边界相关巨噬细胞（BAMs）和内皮细胞（ECs）主要在急性期发生改变。BAMs分为5个亚群，其中bam4亚群几乎只在d02出现，高表达激活相关基因（Spp1， Ccl8）。内皮细胞则分为9个亚群，主要根据动静脉分段和功能状态分类。研究发现，反应性静脉标志物Lrg1在d02的大脑血管中显著上调，且主要定位在大静脉而非毛细血管。这标志着卒中后早期的血管激活和血管新生过程已经开始。
第三，脑内髓系来源细胞（MDCs）由血液炎性单核细胞原位分化而来。这是研究的关键发现之一。脑内MDCs被分为6个亚群。在d02，主要亚群是mdc1和mdc2；到d14，主要亚群变为mdc6。mdc1特征性地表达Arg1，与吞噬凋亡细胞的“胞葬作用”（efferocytosis）相关。mdc6则高表达营养因子Igf1。轨迹分析将外周血单核细胞（mo1， mo2）和脑MDCs连接成一条清晰的分化路径：血液中的炎性单核细胞（Ly6c2高）首先转变为脑内的mdc3（过渡态），然后逐步分化为mdc2、mdc4，最终达到mdc1和mdc6的终末分化状态。这表明，浸润的单核细胞在脑内组织微环境信号的驱动下，能够原位转化为具有特定功能（如促炎症、清除碎片、促进修复）的巨噬细胞。
第四，脑内粒细胞（主要为中性粒细胞）不断从血液中被招募。与MDCs不同，脑内粒细胞的轨迹分析结果显示，脑内的各个粒细胞亚群（gran1-6）与相应时间点的血液中性粒细胞亚群（neu1-6）在转录组上更为接近。例如，d02的脑内粒细胞与d02的血液中性粒细胞相似，而d14的脑内粒细胞则与d14血液中成熟的中性粒细胞（如neu3簇）相似。这提示粒细胞寿命短，在脑内不发生大规模的分化转变，而是持续地从外周循环池中接收新招募的细胞。
第五，衰老和跨物种比较的结果。通过对老年小鼠的研究发现，尽管其核心转录组与年轻小鼠相似，但免疫细胞的组成存在差异。例如，老年卒中大脑中T细胞比例更高，而MDCs比例降低。此外，老年小鼠大脑中多个细胞群的干扰素刺激基因（ISG）评分更高，提示更强的IFN信号。在与人类数据的跨物种比较中，研究者发现在卒中亚急性期，小鼠和人类外周血白细胞的转录通路（如抗原加工呈递、吞噬体、IL-17信号通路等）具有更高的相似性，而在急性期共享的通路较少。这为转化医学研究提供了参考时间窗。
结论与研究价值 本研究系统地绘制了小鼠缺血性脑卒中后，从急性期到亚急性期的大脑和外周血免疫细胞高分辨率转录组图谱。 研究的核心科学结论是：脑内浸润的免疫细胞（特别是单核细胞来源的巨噬细胞）的表型分化主要由局部大脑微环境驱动，而非在外周器官中预先编程。这体现在脑内免疫细胞与其血液中对应细胞相比，展现出更大的转录组差异。 这一发现具有重要的科学意义，它深化了我们对卒中后神经炎症动态过程的理解，揭示了组织微环境在塑造免疫细胞功能中的决定性作用。其次，识别出的特定细胞亚群和关键基因（如mdc6中的Igf1， mdc1中的Arg1， 小胶质细胞和MDC中的Cxcl10等）为未来开发调节特定免疫细胞功能的靶向疗法提供了潜在的分子靶点。此外，通过揭示衰老对免疫反应的改变以及与人类疾病的一致性，特别是在亚急性期的一致性，为未来临床前研究的模型选择和治疗干预的时间窗选择提供了关键指导。为了方便学术界进一步挖掘这些宝贵数据，研究团队还搭建了一个交互式的数据可视化门户网站（https://anratherlab.shinyapps.io/strokevis/），体现了极高的数据共享与应用价值。
研究亮点 本研究的亮点主要体现在以下几个方面：第一，采用了谱系追踪小鼠模型（Cx3cr1-td），首次在单细胞水平上清晰、可靠地区分了脑内常驻巨噬细胞与新浸润的单核细胞来源细胞，解决了该领域长期存在的技术难题。第二，将大脑内部细胞转录组与同一时间点同一动物的外周血细胞转录组进行配对分析和伪时间轨迹比较，揭示了“组织原位分化”这一关键生物学过程，而不仅仅是进行了静态的细胞图谱绘制。第三，研究的时间跨度覆盖了损伤和修复两个关键阶段，并结合了年龄、性别和跨物种等多维度分析，提供了更为全面和立体的视角，远超出了仅关注急性期的常规研究范畴。