作者：Ru Qin（桂林医科大学临床医学系）、Shangyang Li、Boheng Wu、Ruilan Lin、Yulin Yuan（广西壮族自治区人民医院检验科，广西智能精准医学重点实验室）。该研究发表于 *Immunity, Inflammation and Disease*，2024年第12卷，文章编号e70100。

研究背景方面，ADAMTSL5（含I型血小板反应蛋白基序样5的去整合素和金属蛋白酶结构域蛋白）是近年来新发现的一种与银屑病（psoriasis）相关的自身抗原。银屑病是一种由免疫系统介导的慢性皮肤疾病，临床上以红斑和鳞屑为主要表现，病程迁延且易复发。已有研究表明，ADAMTSL5可作为T细胞活化通路中的活化抗原，尤其是在高风险等位基因HLA-C*06:02的提呈下发挥作用。ADAMTSL5不仅表达于黑色素细胞，也表达于角质形成细胞和血管周围真皮细胞。由于银屑病皮损中T细胞群体表现出明显的寡克隆性，提示局部抗原提呈驱动了T细胞活化。然而，目前在原核表达系统中重组表达并纯化ADAMTSL5的研究报道较少。该研究旨在通过大肠杆菌原核表达系统获得具有生物学活性的重组ADAMTSL5蛋白，并利用磁微粒化学发光法检测银屑病患者与健康人血清中抗ADAMTSL5抗体水平，以评估其作为银屑病辅助诊断新标志物的潜力。

研究流程方面，该研究首先进行样本收集，自2023年6月至2023年12月连续纳入广西壮族自治区人民医院皮肤性病科确诊的30例银屑病患者和体检中心的30例健康对照。银屑病患者中男性23例，女性7例，年龄24–80岁，平均年龄48±13岁；健康对照年龄23–58岁，平均年龄39±8岁。排除患有慢性炎症性、过敏性、自身免疫性、代谢性、肿瘤性疾病等可能影响结果的患者。采集静脉血3–5毫升，3000转/分离心10分钟后分离上层血清并保存于−80°C冰箱。其次构建ADAMTSL5-pET-30a载体，设计融合基因序列为NdeI-ATG-His标签-ADAMTSL5-终止密码子-HindIII，基因长度为753个碱基对，克隆至pET-30a载体。采用上游引物ADAMTSL5-F: 5′-TGTATACCCGTGACACTGGT-3′，下游引物ADAMTSL5-R: 5′-GATCCCGCGAAATTAATACG-3′进行PCR扩增，反应条件为95°C预变性5分钟，95°C变性30秒，65°C退火30秒，72°C延伸90秒，共34个循环。PCR产物经15%琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含卡那霉素的LB培养基中筛选，随后用Bam HI和EcoR I双酶切鉴定。接着进行IPTG诱导表达，将质粒转入BL21(DE3)感受态细胞，冰上孵育30分钟，42°C热激90秒，再冰上3分钟，加入室温LB液体培养基后于37°C、200转/分振荡培养60分钟，涂布于卡那霉素抗性平板，37°C倒置培养过夜。挑取单克隆接种于含50 µg/ml卡那霉素的LB管中，37°C振荡培养至OD600达到0.6~0.8，加入0.5 mM IPTG，分别于15°C诱导16小时和37°C诱导4小时，另外设置未诱导阴性对照。收集菌体后用裂解液（50 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、5%甘油、0.5% TritonX-100，pH 8.0）重悬并超声裂解1分钟。蛋白纯化采用亲和层析：将诱导后的菌液离心收集菌体，得菌体30.8克，重悬于裂解液（50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1% Triton、2 mM DTT，pH 7.5及少量核酸酶），超声破碎（3秒开、6秒停、6分钟、功率600瓦），10000转/分离心22分钟后弃上清。包涵体用变性液（50 mM Tris-HCl、7 M盐酸胍、2 mM DTT，pH 8.0）溶解，12000转/分离心30分钟取上清。使用5毫升Ni柱纯化，先用结合缓冲液（50 mM Tris-HCl、8 M尿素，pH 8.0）平衡，上样后用洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl、8 M尿素、20 mM咪唑，pH 8.0）洗涤，最后用洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl、8 M尿素、50 mM咪唑、2 mM DTT，pH 8.0）洗脱，分管收集。将含目标蛋白的洗脱液加入SDS至终浓度0.2%，在含0.2% SDS的1×PBS（pH 7.4）中经14.0 kDa透析膜透析复性过夜，0.22 µm滤膜过滤。临床验证采用磁微粒化学发光法：取离心管，将包被液与磁珠混合，弃上清；加入EDC反应30分钟；再加入100 µg ADAMTSL5蛋白超声20分钟，离心弃上清；用封闭液洗涤三次并超声20分钟；将制备好的ADAMTSL5磁珠、鼠抗人IgG5E9和稀释液加入全自动化学发光分析仪，依次检测30例健康人和30例银屑病患者血清的发光值，数据用GraphPad Prism软件分析。

主要结果方面，构建的ADAMTSL5-pET-30a载体经双酶切和琼脂糖凝胶电泳确认。SDS-PAGE和Western blot分析显示，在0.5 mM IPTG诱导下，工程菌ADAMTSL5-pET-30a/BL21(DE3)在约30 kDa处出现明显条带，与理论分子量约27 kDa相符；未诱导对照无相应条带。目的蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中，为不可溶性表达；最佳诱导条件为15°C诱导16小时，表达量达20 mg/ml，可溶性比例低于1%。Ni柱亲和层析后，SDS-PAGE和Western blot（鼠抗His单抗）均显示约30 kDa处有单一清晰条带，纯化后蛋白浓度为0.96 mg/ml。临床验证中，银屑病患者血清抗ADAMTSL5发光值范围为22,886至294,136 RLU，平均值为129,000±56,341 RLU；健康对照发光值范围为84,285至498,096 RLU，平均值为212,326±114,494 RLU。经GraphPad Prism独立样本t检验分析，银屑病患者血清抗ADAMTSL5水平显著高于健康对照，P<0.001。根据样本量计算公式，每组至少需要10例，考虑15%失访后每组需12例，总计至少24例；本研究每组30例，样本量充足。

结论方面，该研究成功在大肠杆菌原核表达系统中表达了ADAMTSL5重组蛋白，并通过亲和层析纯化获得浓度为0.96 mg/ml的蛋白。利用磁微粒化学发光法证实银屑病患者血清中抗ADAMTSL5抗体水平显著高于健康人，表明原核表达的ADAMTSL5能够与银屑病患者血清中的抗ADAMTSL5抗体结合，具有作为银屑病辅助诊断标志物的潜力。该研究为后续ADAMTSL5功能研究、银屑病发病机制探索以及新型诊断技术的开发提供了原材料和技术支持。

本研究的亮点包括：首次将ADAMTSL5与磁微粒化学发光技术结合用于检测血清抗ADAMTSL5水平，提供了一种新的检测思路；采用大肠杆菌原核表达系统获得ADAMTSL5，相比真核表达系统具有操作简单、成本低、表达量高等优势；研究结果与既往Yulin Yuan等人的报道一致，进一步验证了ADAMTSL5与银屑病的关联。研究局限性在于仅采用单一检测方法分析抗ADAMTSL5水平，未结合其他方法验证蛋白的特异性和准确性，也未对反应性T细胞进行评估。未来研究可进一步优化检测方法，并通过免疫动物制备抗体，以深入探讨ADAMTSL5在银屑病及其他疾病中的免疫机制。