这项研究的通讯作者是Jon D. Piganelli，来自美国匹兹堡大学匹兹堡儿童医院Rangos研究中心儿科外科系。主要作者包括Christina P. Martins（第一作者，来自匹兹堡大学公共卫生研究生院传染病与微生物学系和Rangos研究中心儿科外科系）、Lee A. New、Erin C. O’Connor、Dana M. Previte、Kasey R. Cargill、Isabelle L. Tse和Sunder Sims-Lucas（来自匹兹堡大学匹兹堡儿童医院Rangos研究中心儿科系）。研究于2021年6月7日发表在国际期刊《Frontiers in Immunology》上，属于该期刊的“自身免疫和自身炎症性疾病”专题部分，其完整的引用信息为：Martins CP, New LA, O’Connor EC, Previte DM, Cargill KR, Tse IL, Sims-Lucas S and Piganelli JD (2021) Glycolysis inhibition induces functional and metabolic exhaustion of CD4+ T cells in type 1 diabetes. Front. Immunol. 12:669456. doi: 10.3389/fimmu.2021.669456。
本研究立足于免疫代谢学（Immunometabolism）领域，聚焦于1型糖尿病（Type 1 Diabetes， T1D）的自身免疫发病机制。在1型糖尿病中，自身反应性CD4+ T细胞是启动并驱动胰岛β细胞自身免疫攻击的关键细胞。T细胞的功能与其生物能量程序密切相关，特定的代谢途径是T细胞生命周期各阶段所必需的。当T细胞被激活时，它们会发生代谢重编程，转向效率较低但速度更快的需氧糖酵解（aerobic glycolysis），这与高度增殖的癌细胞类似。基于这一共性，靶向糖酵解途径的抑制剂已在癌症的临床前和临床研究中被成功用于限制肿瘤生长，并同样被应用于抑制系统性红斑狼疮、多发性硬化和类风湿关节炎等自身免疫疾病中的T细胞反应。然而，在1型糖尿病背景下，通过调节T细胞代谢来控制疾病，仍是一个研究不足的治疗机会。此前，本研究团队曾发现，通过破坏T细胞活化“第三信号”中的活性氧，可以干扰T细胞向糖酵解的代谢重编程，从而改变自身反应性CD4+ T细胞的致糖尿病潜能。基于此，本研究的核心假设是：使用糖酵解抑制剂PFK15，将抑制自身反应性CD4+ T细胞的活化、增殖和效应功能，从而延缓1型糖尿病的发病。研究旨在探索特异性调控糖酵解途径是否能限制自身反应性CD4+ T细胞的活化，预防胰岛β细胞攻击，并深入阐明其背后的细胞功能与代谢机制。
研究流程系统而深入，主要包含体外机制探索、体内疾病模型验证以及深入的细胞克隆机制剖析和可逆性研究。研究使用了非肥胖糖尿病（Non-obese Diabetic， NOD）小鼠模型及其衍生品系。实验对象主要包括：来自NOD.BDC2.5.TCR.Tg转基因小鼠（其T细胞受体特异性识别胰岛β细胞抗原）的脾细胞和CD4+ T细胞、NOD.SCID免疫缺陷小鼠（作为过继转移受体），以及长期培养的BDC2.5 T细胞克隆。样本量方面，体外实验通常进行3-6次独立重复，体内过继转移实验每组使用6-7只小鼠。
详细研究流程如下：
体外糖酵解抑制与T细胞功能评估： 首先，研究人员从BDC2.5小鼠分离脾细胞，在体外使用其特异性肽段模拟表位（mimotope， MM）进行刺激，并同时加入PFK15或对照溶剂处理。PFK15是一种靶向PFKFB3（6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶3）的小分子竞争性抑制剂，PFKFB3是决定细胞 commitment 进行糖酵解的关键限速酶。研究人员通过以下方法评估效果：(a) 蛋白质印迹（Western blotting）：检测糖酵解相关蛋白（GLUT-1， HK2， PFKFB3， LDHA）的表达水平。(b) 流式细胞术：使用荧光葡萄糖类似物2-NBDG检测CD4+ T细胞的葡萄糖摄取能力；使用细胞增殖染料（CPDV）稀释法检测增殖；检测早期激活标志物CD69和晚期激活标志物/高亲和力IL-2受体CD25的表达。© 代谢产物与细胞因子测量：使用乳酸仪检测细胞培养上清中的乳酸（糖酵解产物）水平；使用ELISA检测上清中的IL-2、TNF-α和IFN-γ细胞因子。此外，还使用了其他PFKFB3抑制剂（YN1， PFK158）和经典的糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）进行平行对照，以验证PFK15作用的特异性。
体内过继转移模型验证疾病延缓效果： 为验证体外发现的体内意义，研究构建了过继转移模型。具体流程是：从BDC2.5小鼠脾脏分离CD4+ T细胞，在体外使用包被的抗CD3/抗CD28抗体和作为IL-2来源的EL-4细胞上清进行活化和扩增。随后，将1×10^7个活化后的T细胞通过腹腔注射转移到NOD.SCID受体小鼠体内。受体小鼠被分为两组：实验组从转移当天开始，每隔一天腹腔注射PFK15（25 mg/kg），持续两周；对照组注射等体积的溶剂。在整个实验期间，监测小鼠的体重（评估药物毒性）和血糖水平（诊断糖尿病，定义为连续两次血糖读数≥350 mg/dl）。实验终点时，收集小鼠的外周血、脾脏和胰腺组织，进行后续分析。
组织学与免疫荧光分析： 收集的胰腺组织用福尔马林固定、石蜡包埋并切片。通过 (a) 苏木精-伊红（H&E）染色 评估胰岛的免疫细胞浸润程度（胰岛炎）。(b) 免疫荧光染色：使用针对胰岛素（标记β细胞）、CD3（标记T细胞）和PD-1的抗体，共染DAPI（标记细胞核），在荧光显微镜下观察并成像，以评估T细胞浸润、β细胞存活和检查点分子的表达情况。
流式细胞术分析体内T细胞表型： 从过继转移小鼠的外周血和脾脏制备单细胞悬液，通过流式细胞术分析CD4+ T细胞的频率，以及其表面PD-1和LAG-3（两种关键的免疫检查点分子，与T细胞耗竭相关）的表达水平和共表达情况。同时也分析了这些细胞上CD25的表达，以关联其激活状态。
T细胞克隆的长期培养与耗竭表型深度机制研究： 为了更细致地研究PFK15诱导的T细胞状态，研究人员使用了可以长期维持的BDC2.5 T细胞克隆体系。这些克隆细胞在抗原、抗原呈递细胞和IL-2存在下，每两周重新刺激一次。在一部分培养体系中，每隔三天加入PFK15进行处理。在培养的第4、8、14天，通过流式细胞术动态监测PD-1、LAG-3和CD25的表达。在第14天，进行以下分析：(a) 功能评估：计算细胞扩增倍数；使用ELISA检测培养上清中IL-2、TNF-α和IFN-γ的积累量（反映分泌和消耗情况）。(b) 代谢状态深度剖析：
可逆性与终末耗竭验证实验（体外与体内）：
数据分析方法：所有数据以均值±标准误表示。统计学分析采用Student’s t检验、单因素方差分析（one-way ANOVA）或双因素方差分析（two-way ANOVA）。对于糖尿病发病率的生存分析，使用Kaplan-Meier法并计算显著性。P值<0.05被认为具有统计学显著性。使用GraphPad Prism软件进行统计分析和作图。
研究取得了一系列层次分明、逻辑紧密的关键结果：
首先，体外实验证实PFK15有效抑制了自身反应性CD4+ T细胞的糖酵解代谢和功能。与单独抗原刺激组相比，PFK15处理组T细胞的糖酵解关键蛋白（GLUT-1， HK2， PFKFB3， LDHA）表达上调受阻，葡萄糖摄取（2-NBDG荧光）显著降低，上清乳酸分泌减少，明确证明了PFK15干预了T细胞活化时的代谢重编程向糖酵解转变。功能上，PFK15处理并未影响早期激活标志CD69的上调，但显著降低了晚期激活标志CD25的表达，同时强烈抑制了T细胞的增殖（CPDV稀释减少）以及IL-2、TNF-α和IFN-γ的分泌。值得注意的是，经典抑制剂2-DG仅能抑制IFN-γ，而其他PFKFB3特异性抑制剂（YN1， PFK158）能复现PFK15的全面抑制效果，突出了靶向PFKFB3的特异性作用。
接着，体内过继转移模型证明了PFK15治疗能延缓1型糖尿病发病。对照组小鼠在过继转移后7天内全部发病，而PFK15治疗组有57%的小鼠在整个研究期间保持血糖正常，且无显著体重下降。组织学分析显示，对照组胰腺出现侵袭性胰岛炎，胰岛素染色丢失；而PFK15治疗组仅表现为胰岛周围炎（peri-insulitis），胰岛内T细胞（CD3+）浸润减少，胰岛素染色得以保留。流式分析发现，治疗组小鼠外周血中CD4+ T细胞频率不变但CD25+比例下降，脾脏中CD4+ T细胞频率降低但CD25+比例较高，提示活化的效应T细胞可能被阻滞在脾脏，这与糖酵解参与T细胞迁移的报道相符。
深入机制探索发现，PFK15诱导了T细胞耗竭（exhaustion）表型。在过继转移小鼠的外周血和脾脏中，PFK15治疗组CD4+ T细胞表达PD-1和LAG-3的频率和强度均显著高于对照组，且更多细胞共表达这两个分子。更重要的是，对照组中表达PD-1和LAG-3的细胞大多同时高表达CD25（效应表型），而治疗组中这类细胞CD25表达很低（耗竭表型）。胰腺免疫荧光也显示治疗组胰岛内PD-1信号更强。
对BDC2.5 T细胞克隆的长期研究，完整揭示了PFK15诱导的“功能性”与“代谢性”耗竭。在两周的刺激周期中，对照T细胞早期（第4天）上调PD-1/LAG-3，随后下调；而PFK15处理组T细胞则持续高表达这两种检查点分子，且CD25表达持续低下，符合耗竭特征。功能上，处理组T细胞扩增倍数更低，上清中积累了大量未被消耗的IL-2（因其CD25表达低，无法有效利用IL-2），并且TNF-α和IFN-γ分泌能力严重受损。代谢层面，处理组T细胞ATP水平降低，ADP/ATP比值升高，显示能量生成效率低下。除了预期的糖酵解通路被抑制（相关蛋白下调、乳酸减少）外，还出现了线粒体功能失调：线粒体质量下降、膜电位降低、活性氧增加。此外，尽管脂肪酸摄取未变，但调控脂肪酸进入线粒体氧化的关键酶CPT1a在处理后期表达下降，表明脂肪酸氧化也可能受损。这些数据共同描绘了一幅因糖酵解被抑制而导致T细胞全面代谢不足，进而引发功能衰竭的图景。
最后，可逆性实验证明PFK15诱导的耗竭是“终末性”且不可逆的。体外将PFK15 Tex细胞重新刺激，即使撤去药物或联合使用抗PD-1和抗LAG-3阻断抗体，也无法恢复其糖酵解能力（乳酸产生少）和效应功能（IFN-γ分泌少）。体内实验中，虽然联合检查点阻断抗体使PFK15治疗组的保护率从70%（同型对照）降至42%，但两组之间的糖尿病发病率无统计学差异，且治疗组T细胞仍维持高水平的PD-1/LAG-3共表达，表明检查点阻断无法有效逆转PFK15诱导的耗竭状态。
本研究得出结论：靶向PFKFB3抑制糖酵解，能够诱导致病性自身反应性CD4+ T细胞进入一种功能性和代谢性耗竭状态，从而延缓1型糖尿病的发病。这种耗竭表型以PD-1和LAG-3的持续高表达为特征，并伴有严重的代谢功能不全（包括糖酵解受损和线粒体功能障碍），且这种状态是终末性的，无法通过重新刺激或检查点阻断疗法逆转。
该研究的科学价值与应用价值显著：在科学上，它首次在1型糖尿病模型中系统证明了特异性抑制糖酵解关键酶PFKFB3可诱导T细胞终末耗竭，深化了人们对免疫代谢（特别是葡萄糖利用）如何决定T细胞命运（激活 vs. 耗竭）的理解，并将肿瘤免疫和自身免疫领域的代谢研究联系起来。研究强调了营养可用性在慢性感染、癌症和自身免疫中T细胞生物学中的关键作用。在应用上，本研究提出了一种全新的治疗策略：通过利用自身反应性T细胞在活化时的代谢脆弱性（即向糖酵解的重编程），来特异性控制其异常反应，从而恢复自身免疫耐受。PFKFB3成为一个有潜力的新型治疗靶点。与可能导致广泛免疫抑制的疗法（如抗CD3抗体）相比，代谢调控可能更具选择性，主要影响活化的效应T细胞，而对记忆T细胞或调节性T细胞影响较小，这为开发更安全、可能用于疾病预防或与β细胞替代疗法联合应用的免疫干预手段提供了理论依据和实验基础。
本研究的亮点在于：1. 重要的新发现：首次报道在1型糖尿病中，糖酵解抑制可直接导致自身反应性CD4+ T细胞的终末耗竭，这是一种新的疾病干预机制。2. 机制的深度与系统性：研究不仅停留在功能表型，还深入揭示了伴随的代谢重构全景（从糖酵解、线粒体功能到能量状态），将功能耗竭与代谢缺陷紧密耦合。3. 研究设计的严谨性与创新性：结合了体外、体内、细胞克隆模型，并设计了关键的可逆性实验，有力证明了所诱导耗竭的“终末性”本质，这是区别于以往某些代谢干预研究的关键进步。4. 转化医学意义明确：明确指出了PFKFB3抑制剂作为1型糖尿病（尤其是早期干预或预防）的潜在新疗法，并讨论了其相对于现有策略的潜在优势。