关于“上调的PD-L1延迟人中性粒细胞凋亡并在实验性脓毒症小鼠模型中促进肺损伤”的学术报告
一、研究概况
本项原创性研究由海军军医大学附属长海医院麻醉学部的邓小明教授与加拿大多伦多大学圣迈克尔医院的John C. Marshall教授共同领导，王佳锋、王云鹏和谢建为共同第一作者。研究团队还包括来自圣迈克尔医院Keenan生物医学科学研究中心的多位研究人员。该研究成果于2021年5月19日在线发表于《Blood》期刊，并于2021年9月2日正式发表在第138卷第9期。这篇简要报告揭示了程序性死亡配体1（Programmed Death-Ligand 1, PD-L1）在脓毒症中性粒细胞存活和肺损伤中的全新作用机制。
二、研究背景
脓毒症被定义为因宿主对感染的应答失调而导致危及生命的器官功能障碍，是重症监护病房中的首要死亡原因。由于对驱动脓毒症宿主反应分子机制的理解不完全，目前的治疗手段十分有限。既往研究已表明，脓毒症患者存在免疫功能紊乱，其中中性粒细胞（neutrophils）的持续激活和凋亡（apoptosis）延迟是导致非特异性组织损伤的关键因素。
PD-L1是程序性死亡受体1（PD-1）的配体，作为一种共抑制分子，已知其能通过诱导淋巴细胞凋亡来负向调节T细胞应答。研究表明，脓毒症期间，中性粒细胞上的PD-L1表达会上调，并与脓毒症诱导的免疫抑制相关。另一方面，中性粒细胞的凋亡受磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidyl 3-kinase, PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路的调控。基于这些发现，研究者提出关键科学问题：PD-L1是否通过激活PI3K/AKT通路来延迟脓毒症中性粒细胞凋亡，以及中性粒细胞PD-L1在体内脓毒症肺损伤中扮演何种角色。本研究旨在阐明PD-L1对中性粒细胞存活的作用及其在脓毒症相关肺损伤发病机制中的具体功能。
三、研究流程与方法
本研究整合了临床标本分析、体外细胞实验和体内动物模型三个层面的系统性研究。
第一，临床标本检测。研究从多伦多圣迈克尔医院和上海长海医院的重症监护室招募了符合脓毒症临床标准的患者，并以健康捐献者作为对照。研究方案获得了相应机构的伦理委员会批准。研究者通过密度梯度离心法，利用3%葡聚糖（dextran）和Ficoll-Hypaque分离液纯化人外周血中性粒细胞。纯化后，对脓毒症患者和健康对照的中性粒细胞进行了PD-L1表达水平和凋亡率的检测，并分析了两者之间的相关性。
第二，体外细胞机制研究。这部分研究主要使用从健康志愿者血液中纯化的中性粒细胞。为模拟脓毒症微环境，研究者使用干扰素-γ（Interferon-γ, IFN-γ）和脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）在体外刺激中性粒细胞21小时，然后检测PD-L1表达和细胞凋亡率的变化。为验证PD-L1的功能，研究者采用了小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）技术，通过基因沉默（genetic silencing）的方法敲低中性粒细胞中的PD-L1表达，再行上述刺激，观察凋亡率的改变。这一实验在健康对照和脓毒症患者的中性粒细胞上均进行了重复。细胞凋亡通过流式细胞术（flow cytometry）和检测剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）的蛋白水平来评估。信号通路研究方面，研究人员通过免疫印迹法（Western blot）检测了AKT的磷酸化水平。为探索PD-L1与PI3K的相互作用，本研究独创性地使用了共免疫沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）实验。在HEK293细胞中转染绿色荧光蛋白（GFP）标记的PD-L1质粒后，通过免疫沉淀GFP标签，检测其是否与PI3K的p85亚基结合，从而证实两者的直接相互作用。
第三，体内动物模型研究。为明确中性粒细胞PD-L1在活体内的作用，研究者利用CRISPR/Cas9技术构建了PD-L1条件性基因敲除小鼠（PD-L1flox/flox），并将其与Elane（ELA）Cre/Cre工具鼠杂交，成功生成了在中性粒细胞系中特异性敲除PD-L1的小鼠。脓毒症模型采用经典的盲肠结扎穿孔术（Cecal Ligation and Puncture, CLP）。实验比较了基因敲除小鼠和野生型小鼠在CLP术后的多项指标，包括血浆肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和白介素-10（IL-10）的浓度；肺组织的病理学变化，通过苏木精伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）染色进行肺损伤评分；肺组织中性粒细胞的浸润程度，通过免疫荧光染色检测髓过氧化物酶（MPO）阳性细胞数量；以及术后7天的生存率。
四、主要研究结果
研究结果清晰地展示了PD-L1在脓毒症中延迟中性粒细胞凋亡和促进肺损伤的完整通路。
在临床样本和体外刺激实验中，研究者发现IFN-γ和LPS刺激能显著上调健康人中性粒细胞的PD-L1表达，并同时显著延迟细胞凋亡。相关性分析显示，脓毒症患者中性粒细胞的PD-L1表达水平与凋亡率呈显著负相关，即PD-L1越高，凋亡率越低。功能实验的结果进一步证实了这一联系：无论是由IFN-γ/LPS刺激的健康中性粒细胞，还是来自脓毒症患者的中性粒细胞，在被PD-L1 siRNA沉默后，其凋亡率均显著升高。同时，剪切型caspase-3的检测结果也验证了流式细胞术的数据。这些体外实验的结果直接支持了“PD-L1过表达是导致中性粒细胞凋亡延迟的一个原因”这一结论，从而引出对下游机制的探索。
在信号通路机制研究中，结果显示IFN-γ和LPS刺激的健康中性粒细胞以及脓毒症患者中性粒细胞中，PD-L1表达增高的同时，AKT的磷酸化水平也显著增强。当通过siRNA敲低PD-L1后，AKT磷酸化水平随之下降。这提示PD-L1维持了PI3K/AKT促存活通路的激活。Co-IP实验为这一机制提供了最直接的证据，证实了PD-L1能够与PI3K的调节亚基p85形成蛋白复合物。这一发现表明，PD-L1上游信号激活后，通过募集p85亚基来激活PI3K，进而磷酸化AKT，启动下游抗凋亡信号。此外，使用PI3K抑制剂LY294002预处理细胞后，能够阻断由IFN-γ/LPS诱导的AKT活化和促存活效应，并增加caspase-3的切割，这反向证实了PI3K在PD-L1促存活信号中的必要性。这些结果构成了一条完整的信号链：PD-L1与p85相互作用激活PI3K，导致AKT磷酸化，最终延迟中性粒细胞凋亡。
在体内功能验证中，结果与体外机制研究高度一致。与野生型CLP小鼠相比，中性粒细胞特异性PD-L1基因敲除的CLP小鼠表现出显著改善的预后。具体而言，敲除鼠的血浆促炎因子TNF-α和IL-6水平显著降低，而抗炎因子IL-10水平显著升高。肺组织病理学分析显示，PD-L1敲除小鼠的肺损伤评分显著降低，表现为肺泡内炎症细胞和水肿液的减少。与此一致，免疫荧光检测显示肺内MPO阳性的中性粒细胞浸润数量也显著减少。至关重要的是，这种病理生理层面的改善转化为了生存获益：PD-L1敲除的CLP小鼠7天死亡率显著低于野生型CLP小鼠。
五、研究结论与价值
本研究的结论是：在临床和实验性脓毒症中，中性粒细胞上PD-L1的表达增高，通过触发PI3K依赖的AKT磷酸化，启动了促存活信号，从而延迟了细胞的凋亡。这个机制加剧了肺部的中性粒细胞浸润和炎症损伤，并最终导致死亡率的升高。
该研究具有重要的科学价值和应用前景。科学上，它首次揭示了PD-L1作为细胞表面免疫检查点分子，不依赖于其经典受体PD-1，而是通过与PI3K的p85亚基直接互作来激活胞内AKT促存活信号这一全新的非免疫检查点功能，极大地拓展了对PD-L1生物学功能的理解。应用上，它为脓毒症的治疗提供了新的潜在靶点。传统观点认为脓毒症后期处于免疫抑制状态，而本研究则强调了中性粒细胞PD-L1在疾病早期通过延迟凋亡驱动过度炎症和器官损伤的关键作用。因此，靶向中性粒细胞PD-L1可能是减轻脓毒症早期过度炎症反应和肺损伤的一种新策略。
六、研究亮点
本研究具有多个亮点。首先，发现本身具有新颖性，首次阐明了PD-L1通过与p85亚基相互作用激活PI3K/AKT通路来直接促进细胞存活，这是一个超越其作为配体（ligand）进行免疫调节的全新功能。其次，研究设计逻辑严密，从临床观察到体外功能验证，再到体内基因敲除动物模型的表型验证，形成完整的证据闭环。最后，通过构建中性粒细胞条件性敲除小鼠，精确地证明了中性粒细胞来源的PD-L1在脓毒症肺损伤中的独立且关键的作用，排除了其他细胞类型的影响，使得因果关系的阐述非常有力。