关于《一种常见单倍型降低髓系细胞中PU.1表达并延缓阿尔茨海默病发病》研究的学术报告
一、 研究作者、机构及发表信息 本研究由Kuan-Lin Huang, Edoardo Marcora, Anna A Pimenova等30位作者共同完成，他们来自华盛顿大学圣路易斯分校、西奈山伊坎医学院、耶鲁大学医学院、牛津大学、哥伦比亚大学、宾夕法尼亚大学等多个国际知名研究机构。通讯作者为Alison M. Goate。该研究成果于2017年8月发表于国际顶级神经科学期刊《自然·神经科学》（*Nature Neuroscience*）第20卷第8期。
二、 学术背景与研究目标 本研究属于神经退行性疾病，特别是阿尔茨海默病（Alzheimer‘s Disease, AD）的遗传学和分子生物学领域。
研究背景： 1. 遗传关联与机制空白：全基因组关联研究（Genome-Wide Association Study, GWAS）已鉴定出超过20个AD风险基因座，但大多数基因座内的致病基因及其作用机制仍不明确。 2. 髓系细胞的关键作用：近期遗传学和分子证据凸显了髓系细胞（包括小胶质细胞）在AD发病机制中的核心作用。例如，GWAS和测序研究已发现AD与在髓系细胞中表达的基因（如TREM2、ABCA7、CD33）存在关联。 3. 发病年龄的遗传基础：AD发病年龄（Age at Onset, AAO）是一个重要的疾病相关表型，但除APOE外，影响AAO的遗传位点研究甚少。 4. 从关联到因果的挑战：将遗传关联转化为对致病基因和机制的理解，需要整合疾病相关细胞类型中的表达和表观遗传学数据集进行分析。
研究目标： 本研究旨在通过大规模遗传学分析，结合疾病相关表型（发病年龄、脑脊液生物标志物）和细胞类型特异性功能基因组学数据，以发现新的AD风险位点，并阐明其背后的致病基因和生物学机制，特别是聚焦于髓系细胞在AD中的作用网络。
三、 详细研究流程 本研究采用了多层次、整合性的研究策略，流程严谨且环环相扣。
流程一：全基因组生存分析以鉴定与发病年龄相关的基因座 * 研究对象与样本量：研究纳入了国际阿尔茨海默病基因组计划（IGAP）联盟的14，406例AD患者和25，849例非痴呆老年对照样本。 * 研究方法：对超过820万个单核苷酸多态性（SNP）进行了以发病年龄定义生存期（AAOS）的全基因组生存分析Meta分析。 * 数据处理与分析：使用Cox比例风险模型，评估每个SNP与AD发病年龄的关联性。通过基因组膨胀因子（λ）评估人群分层的影响。
流程二：脑脊液生物标志物关联分析以验证遗传位点 * 研究对象与样本量：在一个包含3，646名高加索人的扩展数据集中进行。 * 研究方法：检验在生存分析中达到提示性关联的22个基因座，其SNP与AD关键脑脊液生物标志物（总Tau蛋白、磷酸化Tau181蛋白、Aβ42蛋白）水平的关联。 * 数据处理与分析：使用线性回归模型，并进行多重检验校正（Bonferroni校正）。
流程三：表达数量性状位点分析及共定位分析以确定候选致病基因 * 数据来源： * 脑组织：使用Braineac和GTEx数据库，分析SNP与基因表达的关联（cis-eQTL）。 * 髓系细胞：使用Cardiogenics联盟的738个单核细胞和593个巨噬细胞样本的cis-eQTL数据集，这是本研究的关键创新点。基于前期发现（AD风险等位富集于单核细胞的cis-eQTL效应），研究者假设部分AD相关等位基因的cis-eQTL效应具有髓系细胞特异性。 * 分析方法： 1. 细胞类型特异性富集分析：采用分层连锁不平衡评分回归（Stratified LD Score Regression），利用已发表的220种细胞类型特异性功能注释，评估AD遗传力在不同细胞类型中的富集情况。这是一种新颖的生物信息学方法应用，用于系统性地推断与疾病最相关的细胞类型。 2. cis-eQTL分析：在髓系细胞数据集中，分析AAOS相关SNP及其标签SNP与附近基因表达的关联。 3. 独立验证：在另一个包含432个个体的原代CD14+单核细胞数据集中复制关键的cis-eQTL关联。 4. 共定位分析：使用COLOC和SMR-HEIDI（基于汇总数据的孟德尔随机化与工具变量异质性检验）方法，统计评估疾病关联信号与基因表达关联信号是否由同一个因果遗传变异驱动。这是确定候选致病基因的关键步骤。
流程四：条件分析与精细定位以解析SPI1基因座 * 研究方法：在ADGC数据子集中，对SPI1基因座内多个候选SNP（如rs1057233， rs10838725）进行条件逻辑回归分析，判断哪个SNP携带主要的疾病关联信号。 * 分析目的：确定与AD风险及SPI1表达关联最紧密的遗传变异区域。
流程五：SPI1（PU.1）转录调控网络与功能验证 * 生物信息学分析： 1. PU.1 cistrome分析：利用人类单核细胞和巨噬细胞的ChIP-seq数据，检查AD相关基因的调控区域是否存在PU.1结合位点。 2. 遗传力富集分析：再次使用分层连锁不平衡评分回归，评估AD遗传力在PU.1结合位点（即PU.1 cistrome）的富集程度，以证明PU.1靶基因网络与AD风险的全局性关联。 * 体外功能实验（关键验证环节）： * 研究模型：小鼠小胶质细胞系BV2。 * 实验方法： 1. 基因操作：通过转染cDNA过表达或shRNA敲低SPI1（编码PU.1蛋白）的表达。 2. 吞噬功能检测：使用pHrodo标记的酵母聚糖（Zymosan）生物颗粒，通过流式细胞术检测BV2细胞的吞噬活性。pHrodo在酸性吞噬溶酶体内荧光增强，可特异性指示被内化的颗粒。 3. 下游基因表达分析：通过定量PCR（qPCR）检测PU.1水平改变后，一系列AD相关基因及小胶质细胞功能基因的表达变化。 * 实验设计特点：直接验证遗传学发现的生物学后果，即改变PU.1水平是否影响小胶质细胞的核心功能（吞噬）及其基因表达谱。
四、 主要研究结果 结果1：发现多个与AD发病年龄显著相关的基因座。 全基因组生存分析确认了4个达到基因组水平显著关联的基因座：BIN1， MS4A， PICALM 和 APOE。其中，MS4A基因座是首次被报道与AD发病年龄相关。另外有14个新基因座达到提示性关联。风险等位与更早发病相关，保护等位与更晚发病相关，方向与已知AD风险一致。
结果2：脑脊液生物标志物分析支持SPI1等位基因的功能效应。 在22个候选基因座中，rs4803758（近APOE）和rs1057233（位于SPI1基因座）与脑脊液生物标志物的关联通过了多重检验校正。特别重要的是，保护性等位rs1057233[G]与更高的脑脊液Aβ42水平相关（p = 8.24 × 10^-4），提示其可能减少β淀粉样蛋白沉积。
结果3：AD遗传力在髓系和B淋巴细胞系中特异性富集，而精神分裂症遗传力则富集于脑组织。 分层LD评分回归显示，AD遗传力在髓系和B淋巴细胞系（如CD14+单核细胞、CD19+B细胞）的增强子区域显著富集（例如，单核细胞中富集14.49倍）。这强有力地提示髓系细胞是AD遗传易感性的关键细胞类型，为后续聚焦髓系细胞分析提供了理论依据。
结果4：rs1057233是SPI1基因在髓系细胞中强大的cis-eQTL，且与AD风险共定位。 在Cardiogenics数据集中，保护性等位rs1057233[G]与单核细胞和巨噬细胞中SPI1表达的显著降低存在极强关联（p值分别低至10^-105和10^-87）。共定位分析（COLOC和SMR-HEIDI）表明，AD生存分析关联信号与SPI1的cis-eQTL信号很可能由同一因果变异驱动（后验概率≥0.8）。条件分析也支持rs1057233所在的连锁不平衡区块，而非之前GWAS报道的索引SNP rs10838725，是影响SPI1表达和AD风险的主要区域。此结果将SPI1确立为该基因座最可能的致病基因。
结果5：PU.1结合于多个AD风险基因的调控区，且AD遗传力在其cistrome中富集。 ChIP-seq分析显示，PU.1结合在多个AD风险基因（如ABCA7， CD33， MS4A4A， MS4A6A， TREM2）的启动子或增强子区域。更重要的是，AD遗传力在人类单核细胞和巨噬细胞的PU.1结合位点中显著富集（富集数十倍，p < 0.01），而精神分裂症遗传力则无此富集。这从全基因组层面证明了PU.1调控的髓系细胞基因网络在AD病因学中的特异性作用。
结果6：改变PU.1表达水平可影响小胶质细胞吞噬功能及AD相关基因表达。 功能实验证实： * 吞噬功能：过表达PU.1增强BV2细胞对酵母聚糖的吞噬，而敲低PU.1则削弱吞噬能力。这直接证明了PU.1水平可调节小胶质细胞的核心清除功能。 * 基因表达：敲低SPI1导致多个AD风险基因（如Cd33， Tyrobp， Ms4a4a， Ms4a6d）表达下调，同时导致Apoe和Clu（ApoJ）表达上调。许多参与吞噬、炎症反应、趋化等小胶质细胞功能的基因表达也发生改变。这些结果构建了一个机制模型：遗传变异→SPI1表达改变→PU.1转录活性变化→调控下游AD风险基因及功能基因网络→影响小胶质细胞功能（如吞噬）→最终改变AD易感性。
五、 研究结论与价值 结论： 本研究通过整合遗传学、表型组学和功能基因组学，首次将SPI1（编码转录因子PU.1）确定为AD风险基因座CELF1内的致病基因。保护性等位rs1057233[G]通过降低髓系细胞中SPI1的表达来延缓AD发病、降低风险。PU.1作为髓系细胞发育和功能的关键调控因子，其靶基因网络富集了AD风险遗传信号，构成了AD发病机制中的一个核心调控枢纽。降低SPI1表达可能通过调节髓系细胞（如小胶质细胞）的基因表达和功能（如吞噬）来降低AD风险。
科学价值： 1. 机制突破：超越了简单的遗传关联，深入阐明了从特定SNP（rs1057233）到致病基因（SPI1），再到分子功能（转录调控）和细胞表型（吞噬）的完整因果链条。 2. 细胞类型解析：明确了髓系细胞是AD遗传易感性的主要作用场所，并提供了计算（LD评分回归）和实验证据支持。 3. 网络视角：提出了“PU.1靶基因网络”的概念，将多个看似分散的AD风险基因（如TREM2， CD33， MS4A家族）置于一个统一的转录调控框架下，为理解AD的复杂遗传架构提供了新范式。 4. 治疗靶点：指出SPI1/PU.1是一个潜在的治疗干预靶点，调节其活性或下游通路可能成为AD治疗的新策略。
六、 研究亮点 1. 多层次整合分析：创新性地将GWAS生存分析、脑脊液生物标志物、细胞类型特异性eQTL、表观基因组（ChIP-seq）和体外功能实验无缝衔接，证据链完整、说服力强。 2. 细胞类型特异性洞察：前瞻性地使用髓系细胞eQTL数据而非脑组织匀浆数据，成功发现了在脑数据中被掩盖的关键关联（SPI1 eQTL），并利用分层LD评分回归为这一选择提供了理论支持。 3. 方法学应用娴熟：熟练运用了条件分析、共定位分析（COLOC）、SMR-HEIDI、分层LD评分回归等前沿生物信息学方法，精准定位致病基因并推断细胞类型特异性。 4. 机制与功能直接挂钩：不仅做了生物信息学预测，还通过细胞模型直接验证了PU.1水平变化对小胶质细胞吞噬功能和关键基因表达的影响，将遗传发现转化为可验证的生物学功能。 5. 提出核心调控枢纽：将PU.1提升为AD髓系细胞致病网络中的“主调控因子”，为理解众多AD风险基因的协同作用提供了关键线索。
七、 其他有价值内容 本研究还发现，在MS4A基因座，保护性等位rs7930318[C]与单核细胞/巨噬细胞中MS4A4A和MS4A6A表达的降低相关。在功能实验中，敲低SPI1同样降低了Ms4a4a和Ms4a6d的表达。这提示MS4A基因座可能通过类似的髓系细胞表达调控机制影响AD风险，并且其表达可能受到上游PU.1的调控，进一步巩固了PU.1作为网络核心的观点。此外，研究还通过分析提示VLDLR等基因可能与AD相关，拓宽了未来研究的候选基因列表。