类型a：学术研究报告

主要作者及机构
本研究由P. Danesi（意大利Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie）、C. Falcaro、K. Dukik（荷兰Westerdijk真菌生物多样性研究所）、Y. Jiang、A. P. Rizzoli（意大利Fondazione Edmund Mach）、R. Allavena（澳大利亚昆士兰大学）、V. Simpson（英国野生动物兽医调查中心）、S. Ravagnan、C. Zanardello、G. Capelli及G. S. de Hoog（荷兰Radboudumc/CWZ真菌学中心）共同完成。研究发表于2019年的《Mycopathologia》期刊。

学术背景
本研究聚焦于野生动物中Emmonsia样真菌的分子诊断。Emmonsia属真菌是引起小型哺乳动物肺部疾病（称为“adiaspiromycosis”，即“无性孢子菌病”）的双相性真菌，其特征是在宿主组织中形成大型休眠细胞（adiaspores）。传统上，该病通过显微镜或组织病理学诊断，但缺乏可靠的血清学检测方法，且培养成功率低。近年来，分子分类学研究表明，原Emmonsia parva与Blastomyces dermatitidis亲缘关系密切，被重新归类为Blastomyces parvus。此外，新发现的Emergomyces属真菌在免疫缺陷人群中可引起严重播散性疾病（emergomycosis，即“突发性真菌病”）。由于Emmonsia样真菌的感染可能被低估，本研究旨在建立一种分子检测方法，用于野生动物中Emmonsia样真菌的筛查和鉴定。

研究流程
1. 样本收集与处理
- 研究对象：215只野生动物（包括啮齿类、鼬科动物、水獭、袋熊等）的肺组织，其中197份为冷冻组织，18份为福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。
- 样本来源：意大利、英国和澳大利亚的野生动物尸体解剖。
- 样本处理：冷冻组织使用商业DNA提取试剂盒（DNeasy Blood & Tissue Kit）提取DNA；FFPE组织通过切片（5–10 μm）后提取DNA。

1. 分子检测方法开发

   • 设计特异性引物：针对核糖体操纵子的ITS（内转录间隔区）和LSU（大亚基）基因片段，设计多组引物（如EmmITS-12/EmmITS-187、EmmLSU-70/EmmLSU-298等），以扩增短片段（160–370 bp），提高FFPE样本的检测灵敏度。
     
   • 实时荧光定量PCR（SYBR Green）：采用两步法扩增，阴性对照（无菌水）和阳性对照（Emmonsia DNA）确保实验准确性。
     
   • 测序与系统发育分析：对阳性扩增产物进行双向测序，通过ClustalW和MEGA v6.1软件进行序列比对和最大似然法（ML）建树，以确定真菌种类。
     

2. 数据分析

   • 序列比对：将获得的ITS和LSU序列与GenBank数据库中的Emmonsia、Blastomyces、Emergomyces等属的参考序列比对。
     
   • 系统发育树构建：以Coccidioides immitis和Arthroderma flavescens为外群，分析菌株间的进化关系。
     

主要结果
1. 检测阳性率
- 11/215份样本（5.1%）检测到Emmonsia样真菌DNA，包括冷冻组织（4例：黄颈鼠1例、河鼠4例）和FFPE组织（7例：鼬科动物5例、袋熊2例）。
- ITS和LSU引物在冷冻组织中均成功扩增，而FFPE样本仅LSU引物可稳定测序。

1. 物种鉴定

   • 欧洲样本（鼠类、水獭、河鼠）中主要检出Emmonsia crescens。
     
   • 两只水獭和一只鼬的样本为Blastomyces parvus。
     
   • 两只澳大利亚袋熊中发现一种新的Emmonsiellopsis属物种，其LSU序列与已知Emmonsiellopsis coralliformis和E. terrestris均不同。
     

2. 系统发育分析

   • LSU树显示E. crescens与Blastomyces、Emergomyces等属明显分开，而袋熊菌株位于Emmonsiellopsis分支（支持率95%）。
     
   • 鼬科动物样本中检测到两种序列型（ST1/ST2为E. crescens，ST3为B. parvus），支持了传统分类中“adiaspore大小差异反映物种差异”的假设。
     

结论与意义
1. 科学价值
- 首次在野生动物中系统鉴定Emmonsia样真菌的多样性，证实欧洲以E. crescens为主，而B. parvus和Emmonsiellopsis新种的存在拓展了该类真菌的宿主范围和地理分布认知。
- 开发的分子方法（尤其是针对FFPE样本的LSU引物）为未来回顾性研究和流行病学调查提供了工具。

1. 应用价值
   
   • 纠正了传统依赖adiaspore大小鉴定的局限性（如宿主免疫反应可能导致尺寸变异），推动分子诊断在野生动物疾病监测中的应用。
     
   • 提示Emmonsia样真菌可能通过掘穴行为传播（如袋熊和水獭均为穴居动物），为生态传播机制研究提供线索。
     

研究亮点
1. 方法创新：针对降解DNA的FFPE样本优化短片段PCR引物，解决了传统ITS扩增失败的问题。
2. 新物种发现：在袋熊中鉴定出Emmonsiellopsis属新种，丰富了Ajellomycetaceae科的分类框架。
3. 跨物种感染证据：证实同一地理区域内（如英国）不同宿主（水獭与鼬）可能感染不同真菌物种，暗示宿主适应性差异。

其他有价值内容
研究还讨论了adiaspores的生态学意义：这类休眠细胞可能通过宿主死亡或被捕食释放到环境中，但具体传播途径仍需进一步验证。此外，尽管多数感染动物未表现临床症状，但在袋熊和水獭中观察到严重的肺部肉芽肿病变，提示某些物种可能更易感。