本研究由来自美国俄勒冈州立大学的 Scott W. Leonard、Gerd Bobe 和 Maret G. Traber 共同完成，其成果以“Stability of antioxidant vitamins in whole human blood during overnight storage at 4 °C and frozen storage up to 6 months”为题，发表于 Int J Vitam Nutr Res. 期刊2018年6月刊。

学术背景 本研究属于临床营养学与生物样本分析方法的交叉领域。在临床试验中，血液样本的采集与处理流程对后续分析结果的准确性至关重要。然而，实际操作中常因物流或人员安排等原因，无法在采血后立即分离血浆，导致全血样本需要在4°C条件下冷藏过夜。因此，评估在这种条件下血液中关键抗氧化维生素（如维生素E、维生素C及其代谢物）的稳定性，对于确保临床研究数据的可靠性具有重要的现实意义。此前的研究已对血浆维生素E（生育酚）在不同储存条件下的稳定性进行过探讨，但结论不尽一致，且关于其代谢产物——羧乙基羟色满醇（Carboxyethyl hydroxychromanol, CEHC）的稳定性数据尚属空白。同时，抗凝剂的选择（如EDTA与肝素）对维生素C（抗坏血酸）稳定性的影响也存在争议。基于此，本研究旨在系统评估全血在4°C过夜储存（约30小时）以及随后血浆在-80°C长期储存（长达6个月）过程中，不同抗凝剂（EDTA、Li-肝素、Na-肝素）对血浆α-生育酚、γ-生育酚、α-CEHC、γ-CEHC及抗坏血酸浓度稳定性的影响。研究假设肝素（而非EDTA）能有效保护血浆中的这些抗氧化物质免受氧化损伤。

详细研究流程 本研究设计严谨，流程清晰，主要包括样本采集与处理、生化分析、数据统计三大环节，并涉及多种先进检测技术的比较。

1. 研究对象与样本采集：研究招募了8名健康成年志愿者（6男2女）。从每位受试者的肘前静脉非空腹采集共60毫升血液，分别注入六支10毫升的真空采血管中，每种抗凝剂（EDTA、Li-肝素、Na-肝素）各两支。采血后，样本立即置于冰上。

2. 样本处理与储存方案：这是研究的核心处理环节。对于每种抗凝剂，一套采血管在采集后立即进行处理（即时处理组），另一套则置于4°C冰箱中储存约30小时后再处理（过夜储存组）。处理过程包括在4°C下以2000×g离心15分钟分离血浆。分离出的血浆随后分装成约1毫升的等份，并储存于-80°C超低温冰箱中直至分析。此外，为了评估长期储存的影响，一部分即时处理和过夜储存后得到的血浆样本在-80°C下保存了6个月后进行再次分析。对于抗坏血酸分析，取100微升血浆与等体积的含1 mmol二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）的5%偏磷酸混合，以稳定抗坏血酸，然后离心取上清液于-80°C保存。

3. 生化分析方法：研究采用了多种高灵敏度、高特异性的色谱分析技术。

   • 生育酚分析：采用改良的Podda等方法。简要步骤是：血浆样本经含抗坏血酸的醇性KOH皂化，用己烷萃取，氮气吹干后复溶于乙醇:甲醇（1:1）溶液中。关键创新在于，同一份提取物使用了三种不同的检测器联用高效液相色谱（HPLC）进行分析比较：
     • 电化学检测器（ECD）：使用等度洗脱，流动相为含0.1%高氯酸锂的甲醇:水（99:1）。
     • 单四极杆质谱（LC-MS）：使用大气压化学电离源负离子模式，以氘代α-生育酚（d9-α-生育酚）为内标，监测α-生育酚（m/z 429）、γ-生育酚（m/z 415）和d9-α-生育酚（m/z 438）的离子。
     • 三重四极杆质谱（LC-MS/MS）：同样使用负离子模式，但采用多反应监测模式，监测更特异的离子对碎片（如γ-生育酚 415/149，α-生育酚 429/163，d9-α-生育酚 438/172），进一步提高了检测的选择性和准确性。
   • CEHCs分析：采用改良的Li等方法。血浆中的CEHCs经酸水解（60°C，1小时）释放其结合形式，然后用乙醚萃取。萃取物经氮气吹干后复溶于水:甲醇（1:1）溶液中，并以Trolox为内标，使用LC-MS（单四极杆）进行定量分析，监测α-CEHC（m/z 277）、γ-CEHC（m/z 263）和Trolox（m/z 249）的离子。
   • 抗坏血酸分析：采用基于Frei等方法的配对离子反相HPLC-ECD法。将酸化的血浆样本与含DTPA和磷酸盐缓冲液的洗脱液混合后进样分析，使用玻璃碳工作电极在+0.6 V电位下检测。

4. 数据分析流程：所有统计分析均使用专业的统计软件（Prism 5和SAS 12.1）完成。数据首先进行了方差齐性和残差正态性检验。主要采用混合模型方差分析。为比较不同检测器，模型中的固定效应包括检测器类型、过夜储存（是/否）、抗凝剂类型及其交互作用。为比较储存条件和抗凝剂，模型中的固定效应包括30小时储存（是/否）、长期储存（是/否，仅用于生育酚分析）和抗凝剂类型及其交互作用。所有模型均以受试者作为随机效应。计算了检测器之间的皮尔逊相关系数以评估一致性。数据以均值±标准差或个体值表示，P < 0.05被认为具有统计学显著性。

主要研究结果 研究结果清晰地回答了关于不同抗氧化物质在不同储存条件下的稳定性问题。

1. 生育酚及其代谢物CEHCs的稳定性：

   • 过夜储存（4°C）的影响：无论使用何种抗凝剂（EDTA、Li-肝素或Na-肝素），全血在4°C下储存30小时，对血浆中的α-生育酚、γ-生育酚、α-CEHC和γ-CEHC的浓度均未产生显著影响（P值均>0.05）。图1和图2直观地展示了这一结果，个体数据点在处理后即时组与过夜储存组之间高度重叠。
   • 长期冷冻储存（-80°C，6个月）的影响：对同一批血浆样本进行6个月储存后的分析显示，α-生育酚浓度保持稳定（P=0.68），但γ-生育酚浓度出现了统计学上显著的下降，平均降幅约为9%（P<0.0001）。抗凝剂类型对长期储存后的生育酚浓度无显著影响。
   • CEHCs的稳定性：α-CEHC和γ-CEHC在过夜储存条件下同样稳定，且不受抗凝剂类型的影响（图2）。这表明这些水溶性的维生素E代谢产物在全血中同样具有良好的短期稳定性。

2. 抗坏血酸的稳定性：

   • 结果揭示了抗凝剂选择的决定性作用（图3）。统计分析显示，抗凝剂类型与储存时间之间存在显著的交互作用（P=0.02）。
   • 在即时处理的样本中，使用EDTA抗凝的样本，其血浆抗坏血酸浓度就显著低于使用Na-肝素或Li-肝素的样本，降幅分别为39%和41%。
   • 经过30小时4°C储存后，EDTA抗凝样本中的抗坏血酸损失加剧，下降了75%（P<0.0001）。相比之下，使用Li-肝素或Na-肝素的样本，在过夜储存后抗坏血酸浓度虽有轻微下降，但未达到统计学显著性（P值分别为0.08和0.14）。这表明肝素能有效保护全血中的抗坏血酸在冷藏过夜期间不被快速氧化，而EDTA则不能，甚至在采血后即刻就已有明显损失。

3. 不同检测系统的比较：

   • 使用ECD、LC-MS和LC-MS/MS三种检测器测得的血浆α-生育酚和γ-生育酚浓度具有高度相关性（相关系数r均>0.92，P<0.0001）。尽管不同检测器测得的绝对浓度存在约10%的差异（图4），但这种差异在实验室间比较的可接受范围内。
   • 方差分析表明，生育酚浓度的差异主要来源于检测器本身，而与过夜储存或抗凝剂类型无关（交互作用P>0.23）。这验证了质谱方法与传统电化学方法在测定生育酚方面的一致性。
   • 研究还报告了各检测方法的日内和日间精密度数据，均在可接受范围内，进一步证实了分析方法的可靠性。

研究结论与价值 本研究得出以下明确结论：全血在4°C下冷藏过夜（约30小时）不会导致血浆α-生育酚、γ-生育酚及其代谢物α-CEHC和γ-CEHC浓度的显著下降，且这一稳定性不受EDTA或肝素抗凝剂的影响。然而，对于抗坏血酸，抗凝剂的选择至关重要：使用肝素抗凝管可以允许全血在4°C过夜储存而抗坏血酸无明显损失；但若使用EDTA抗凝管，即使在即时处理时抗坏血酸已有损失，过夜储存会导致其浓度急剧下降75%。此外，血浆在-80°C下储存6个月，α-生育酚保持稳定，但γ-生育酚会有约9%的下降。

本研究的科学价值在于，它首次系统地评估了维生素E代谢物CEHCs在血液样本储存中的稳定性，填补了该领域的知识空白。其应用价值极为直接和重要：为临床研究和流行病学调查中的血液样本采集、处理和储存标准操作程序提供了关键且基于实证的指导。研究结果明确指出，在无法立即分离血浆并酸化的场景下（如夜间采样），若需测定抗坏血酸，应优先选用肝素抗凝管，而避免使用EDTA管。对于生育酚及其代谢物的测定，则无需担心短时冷藏的影响。这有助于提高相关生物标志物检测数据的准确性和可比性。

研究亮点 1. 研究对象的创新性：首次全面评估了维生素E代谢产物α-CEHC和γ-CEHC在全血储存过程中的稳定性，拓展了维生素E相关生物标志物预处理的知识。 2. 对照设计的系统性：同时比较了三种常用抗凝剂（EDTA、Li-肝素、Na-肝素）和两种储存条件（即时处理 vs. 过夜冷藏；短期 vs. 6个月冷冻）对多种抗氧化物质的影响，设计全面且对照严谨。 3. 方法学的验证与比较：创新性地在同一研究中对同一样本使用了三种不同的检测技术（HPLC-ECD, LC-MS, LC-MS/MS）分析生育酚，不仅验证了质谱新方法与传统方法的可比性，也为不同实验室根据自身条件选择检测方法提供了依据。 4. 明确的实践指导意义：研究结论直接转化为可操作的样本处理指南，特别是关于抗坏血酸测定时必须使用肝素抗凝管并尽快处理的警告，对规范临床研究操作、减少分析前误差具有重要价值。

其他有价值的内容 研究在讨论部分对结果进行了深入分析。作者推测EDTA可能导致抗坏血酸不稳定的原因，可能是其作为金属螯合剂，在某些条件下反而起到了促氧化剂的作用，并引用其他文献支持这一观点。此外，作者提及他们之前的一项研究中曾观察到类似现象但未深入探讨，而本研究则明确揭示了这一问题。这些讨论增加了研究的深度和说服力。研究还证实，即使在极低浓度范围（nmol/L级别），CEHCs的测量也具有足够的稳定性，支持了其作为维生素E状态生物标志物的应用潜力。