主作者 Paula Ludovico 与通讯作者 Manuela Côrte-Real 隶属于葡萄牙米尼奥大学（Universidade do Minho）生物系环境科学中心，另一位作者 Filipe Sansonetty 来自波尔图大学分子病理与免疫学研究所流式细胞术实验室。该研究发表于 Microbiology (2001), 147, 3335–3343。

本文献属于类型a，即单项原创研究，研究主题为利用流式细胞术评估酵母细胞群体的线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, ∆ψm）。线粒体是真核细胞中通过氧化磷酸化合成ATP的主要场所，该过程依赖于线粒体内膜上的呼吸电子传递链和ATP合酶复合体。电子传递释放的能量用于将质子泵出线粒体基质，从而形成由质子梯度（∆pH）和电化学梯度（∆ψm）共同组成的质子动势（∆p）。由于∆p不能直接测定，通常需要分别评估∆ψm和∆pH。罗丹明123（rhodamine 123, rh123）是一种膜通透性亲脂性阳离子荧光染料，可依据Nernst方程在线粒体基质中大量累积，其累积程度与∆ψm直接相关。在酵母中，rh123此前主要用于评估线粒体呼吸功能以及区分呼吸正常与呼吸缺陷细胞，但尚未形成可用于完整酵母细胞∆ψm变化定性评估的优化流式细胞术染色方案。因此，本研究的目标是优化并验证一种低浓度rh123染色方案，结合流式细胞术监测完整酵母细胞中∆ψm的变化，并排除非特异性结合和染料细胞毒性对结果的干扰。

研究的工作流程包括多个连续步骤。首先，研究使用了三种酵母菌株：Zygosaccharomyces bailii ISA 1307、Saccharomyces cerevisiae IGC 4072以及Saccharomyces cerevisiae J-1-3突变株（ADP/ATP转运体缺失突变株）。细胞在合成培养基中培养至早期或晚期指数生长期，离心洗涤后重悬于无菌水（pH 6.0），使细胞浓度约为1×10⁷ cells ml⁻¹。热灭活细胞作为死细胞对照，通过煮沸细胞悬液10 min制备。其次，研究对rh123染色条件进行了系统优化。作者考察了染料浓度、细胞浓度比例、pH、温度、孵育时间和染色介质组成等因素。流式细胞术分析采用EPICS XL-MCL（Beckman-Coulter）流式细胞仪，配备488 nm氩离子激光器，绿色荧光通过525 nm带通滤光片收集，每个样本分析2万个细胞，前向散射光（forward scatter, FS）、侧向散射光（side scatter, SS）和绿色荧光（FL1）均以四十年对数刻度采集。由于流式细胞仪测量的是每个细胞的总荧光量，而不直接反映染料浓度，因此相同染料浓度但体积不同的细胞会显示不同荧光水平，可能被误判为∆ψm差异。为此，作者引入了归一化参数R，即绿色荧光对数值与FS对数值之比，用以校正细胞体积和线粒体浓度的影响。荧光显微镜采用Leitz Laborlux S落射荧光显微镜，配备50 W汞灯和BP 450–490激发滤光片、FT510分光镜及LP520发射滤光片。由于荧光显微镜灵敏度较低，镜下观察时rh123浓度提高至500 nm，但染料与细胞数比例与流式分析时保持一致。

在染色条件优化中，rh123浓度从10 nM到200 nM范围内逐步增加时，活细胞荧光强度逐步上升，而热灭活细胞的荧光强度显著高于活细胞，且在荧光显微镜下呈弥漫性胞浆分布，而活细胞则主要表现为线粒体染色和少量细胞被膜非特异性荧光。R值的使用提高了荧光分布的同质性。最终选择50 nM作为FCM染色浓度，因为该浓度既能明显区分于自发荧光，又能敏感检测荧光强度下降，且对两种酵母均无细胞毒性。动力学研究显示rh123摄取非常迅速，约10 min达到稳态。荧光显微镜观察发现5 min时的快速摄取主要来自染料与细胞被膜的非特异性结合，而10 min后rh123已被电泳累积到线粒体内，形成特异性线粒体染色。细胞在染色后30 min内荧光保持稳定，但转移至无染料介质后荧光下降，提示探针在胞内外建立新的分布平衡。温度方面，室温和37 °C下染色荧光无差异，因此选择室温。在pH 3.0和pH 6.0条件下荧光水平相似，表明rh123的线粒体累积不受胞外pH显著影响，也提示质膜电位（∆ψp）对线粒体累积的贡献很小。在介质组成比较中，无菌水中染色荧光显著高于矿物培养基和PBS缓冲液。此外，研究还评估了生长阶段对染色的影响，发现S. cerevisiae的rh123染色随生长阶段变化，晚期指数期仅需10 nM即可获得与早期指数期50 nM相近的荧光，而Z. bailii在不同生长阶段均需50 nM。因此最终染色方案为：细胞重悬于无菌水，浓度1×10⁷ cells ml⁻¹；晚期指数期S. cerevisiae用10 nM rh123，早期指数期S. cerevisiae和Z. bailii用50 nM rh123；室温避光染色10 min。

在方案验证阶段，研究利用多种影响线粒体能量代谢的化合物处理细胞，以检验rh123累积是否与∆ψm变化一致。缬氨霉素（valinomycin）和FCCP在所测浓度下未改变rh123累积，作者引用前人观点认为这可能与化合物和线粒体内膜组分形成复合物有关，部分复合物在去能化状态下才暴露结合位点。叠氮化钠（sodium azide）作为电子传递抑制剂、2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose）作为ATP耗竭剂以及饥饿处理均导致rh123累积下降，与∆ψm降低一致，且前两者对热灭活细胞无影响。寡霉素（oligomycin）抑制F₀F₁-ATP合酶，模拟ATP需求降低的状态，导致rh123染色增强；尼日利亚菌素（nigericin）消散∆pH并引发∆ψm超极化，也增加了rh123荧光。琥珀酸（succinate）为呼吸链提供还原当量，增加了活细胞中rh123的累积。S. cerevisiae J-1-3菌株为ADP/ATP转运体缺失突变株，与亲本菌株相比表现出小幅但显著的∆ψm下降；当该突变株经叠氮化钠处理后，呼吸功能被完全抑制，∆ψm崩溃，rh123不再累积于线粒体，其荧光强度接近自发荧光水平。这一结果特别有力地证明了低浓度rh123染色的特异性，即在∆ψm被破坏时线粒体累积被阻止，残余荧光几乎全部来自细胞自身荧光，而非非特异性结合。

综合上述结果，研究得出了以下结论。首先，相对细胞体积会影响荧光测量，若不校正可能导致对∆ψm的误判，因此R值归一化是必要的。其次，50 nM rh123远低于文献中常用的数十微摩尔至数百纳摩尔浓度，此低浓度条件下染料细胞毒性和对非线粒体细胞器的非特异性结合均被消除或降至可忽略水平。第三，在优化的染色条件下，去极化或超极化处理分别导致R值降低或升高，证明rh123荧光变化确实反映∆ψm的变化。第四，活细胞与死细胞之间R值差异显著，提示该方案还可用于酵母活死细胞判别。第五，虽然rh123荧光变化主要反映∆ψm，但作者也指出线粒体质量变化或胞质染料浓度变化可能独立影响rh123累积，因此在怀疑线粒体含量变化时，应结合线粒体结构探针（如nonyl acridine orange）进行补充分析。第六，不同酵母物种之间以及同一物种不同生长阶段之间，最佳rh123浓度可能不同，这与呼吸代谢和线粒体成熟程度有关，因此将该方案应用于新物种时应先进行预实验确定最佳染色条件。

本研究的主要亮点在于：建立了完整酵母细胞中低浓度rh123流式细胞术评估∆ψm的标准化方案；引入R值以消除细胞体积和线粒体浓度对荧光信号的影响；系统验证了该方案在不同药理和遗传操作条件下的响应性；并展示了其在区分活死细胞以及评估线粒体功能变化方面的应用潜力。该研究还为后续酵母程序性细胞死亡中线粒体功能变化的研究提供了重要工具，尤其是在酵母凋亡过程中∆ψm变化的快速检测方面。虽然JC-1等探针也可用于∆ψm检测，但rh123对∆ψm变化的响应速度更快，因此更适合评估快速动态变化。该研究的科学价值在于为酵母线粒体功能研究提供了可重复、低毒性的流式细胞术检测方法，应用价值体现在可广泛用于药物筛选、线粒体能量代谢紊乱评估以及酵母细胞死亡机制研究中。