本研究由浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院老年科、浙江省老年慢性病中医药预防与治疗重点实验室的石莹莹（Yingying Shi）和浙江大学药学院的楼泽亮（Zeliang Lou）作为共同第一作者完成，通信作者为王玉乐（Yule Wang）和高月（Yue Gao）。该研究发表于《Nano Research》期刊2025年第18卷，文章编号94908192，DOI为10.26599/nr.2025.94908192。研究团队联合了浙江大学药学院和贵州中医药大学药学院等多家科研机构，于2025年9月5日投稿，同年10月23日被接收发表。
炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）是一类主要累及胃肠道的慢性炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）和克罗恩病（Crohn’s disease, CD）。该病全球患病率较高，临床特征表现为反复腹泻、腹痛、便血和体重下降，严重影响患者生活质量并给全球医疗系统带来沉重负担。目前IBD的病因复杂，涉及遗传、环境和免疫因素的交互作用，临床上尚无根治手段。
现有治疗策略主要依赖抗炎药物，包括氨基水杨酸类、糖皮质激素、免疫调节剂和生物制剂等。大多数患者需要终身服药来控制症状，但这些药物普遍存在靶向性不足、继发性失应答、不良反应严重以及生物制剂成本高昂等问题。在给药途径方面，肠道给药（enteral administration）是目前IBD治疗最常用的方式，包括口服和直肠局部给药。然而，胃肠道严酷的微环境和复杂的生理屏障会损害药物稳定性，导致病灶部位蓄积不足、生物利用度低以及不良反应。直肠给药虽然可直接作用于病灶，但患者依从性差、病灶覆盖范围有限且药物滞留时间短。
相比之下，肠外给药（parenteral administration）能够绕过胃肠道，将药物直接递送至循环系统或其他组织。临床上，针对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的英夫利昔单抗（infliximab）和阿达木单抗（adalimumab）以及针对白细胞介素-12/23的乌司奴单抗（ustekinumab）等生物制剂在诱导期通常采用静脉注射、在维持期采用皮下注射。然而，这些药物的反复使用受到免疫原性、循环稳定性差、抗体耐药产生以及高成本的限制。
值得注意的是，腹腔注射（intraperitoneal injection, i.p.）作为一种肠外给药途径，具有独特的解剖学优势：腹腔壁内丰富的毛细血管和淋巴网络有利于药物的高效吸收和全身循环，同时可通过淋巴转运实现结肠靶向。然而，关于腹腔注射药物纳米粒子用于IBD治疗的研究极为有限，药物能否穿透肠壁到达黏膜侧、是否通过淋巴器官间接调节炎症等关键科学问题尚不明确。
基于上述背景，本研究旨在系统评估腹腔注射他克莫司（tacrolimus, FK506）载药核壳纳米粒子（FK506-core/shell）治疗IBD的可行性及其作用机制，并与无壳层包覆的FK506-core纳米粒子进行对比分析。研究团队此前已开发了用于递送钙调神经磷酸酶抑制剂FK506和同种异体抗原的核壳结构纳米粒子，并证实其可通过细胞间免疫通讯实现抗原特异性T细胞的靶向抑制，从而缓解小鼠同种异体皮肤移植排斥。本研究将该纳米平台拓展应用于IBD治疗领域。
本研究包含多个层次的实验程序，涵盖纳米粒子制备与表征、体外细胞实验、体内生物分布分析、腹腔免疫细胞摄取与组织穿透评估、DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型的治疗实验以及免疫重塑分析等环节。
研究采用两步微流控混合技术制备核壳结构纳米粒子。在第一阶段，含有FK506和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）的丙酮相作为中心流，与两侧的水相在十字通道中混合，生成载药聚合物核心纳米粒子。在第二阶段，核心纳米粒子与含有脂质成分（DOTAP:DOPE:DSPE-PEG2k:胆固醇，摩尔比为50:20:1.5:28.5）的乙醇相进行垂直冲击混合，使脂质膜沉积在聚合物核心表面形成核壳结构。未包覆脂质壳的FK506-core纳米粒子作为对照。
动态光散射（DLS）测定结果显示，FK506-core纳米粒子的流体力学直径为173.5 ± 18.8 nm，表面电位为-11.6 ± 0.2 mV，多分散指数（PDI）为0.06 ± 0.02，透射电镜（TEM）下呈现均一的球形形貌。FK506-core/shell纳米粒子的流体力学直径为180.9 ± 3.2 nm，表面电位反转为+37.9 ± 1.0 mV，证实脂质包覆成功，PDI为0.22 ± 0.02。TEM图像分析表明核心半径约为102.5 ± 29.4 nm，壳层厚度约为15.0 ± 6.2 nm。高效液相色谱（HPLC）分析显示，FK506-core的包封率为24.6% ± 0.6%，FK506-core/shell的包封率提升至37.0% ± 2.1%。体外释放实验表明，两种纳米粒子均能实现长达7天的持续释放，其中FK506-core/shell在第7天仅释放约20%，显著慢于FK506-core的约40%，这可能归因于外层脂质膜的保护作用。
体外细胞毒性实验采用了小鼠原代脾淋巴细胞（SPLCs）、骨髓来源树突状细胞（BMDCs）、永生化树突状细胞系（DC2.4）和巨噬细胞系（RAW264.7）等多种细胞类型，结果显示FK506-core/shell对细胞活力的抑制作用强于FK506-core，且在DC2.4和RAW264.7细胞中达到统计学显著差异。细胞摄取实验证实FK506-core/shell具有更高的细胞摄取效率。
为确定最佳给药途径，研究比较了静脉注射（i.v.）、腹腔注射（i.p.）和皮下注射（s.c.）三种肠外给药方式。实验使用疏水性荧光染料DiR标记PLGA核心，以C57BL/6小鼠（每组n=4）为实验对象，在给药后3、6、10、24和48小时进行活体成像分析。结果显示，静脉注射后纳米粒子主要蓄积于肝脏（FK506-core占87.5%，FK506-core/shell占48.2%），这归因于单核吞噬系统的快速清除效应。腹腔注射后，FK506-core/shell在结肠的蓄积比例达到24.4%，显著高于其他给药途径，同时在脾脏（29.8%）和肝脏（37.2%）也有明显分布。皮下注射后纳米粒子主要滞留于注射部位皮肤（46.7%–60.6%）。在淋巴结引流方面，腹腔注射在肠系膜淋巴结（mesenteric lymph nodes, MLNs）中的蓄积效率最高，而皮下注射更有利于外周淋巴结（腹股沟淋巴结和腋窝淋巴结）的引流。
为优化壳层组成，研究通过替换阳离子脂质DOTAP为可电离脂质DLin-MC3-DMA（MC3）、阴离子脂质大豆磷脂酰胆碱（S100）或蛋黄磷脂酰甘油（EPG），制备了四种核壳纳米粒子。动态光散射分析显示这些纳米粒子的粒径在150–250 nm范围内，PDI均低于0.2。表面电位呈现梯度降低趋势，其中core/shell-S100和core/shell-EPG转为负值。使用DiR标记脂质膜、FITC偶联PLGA标记核心，在腹腔注射后24小时分析各器官的荧光分布。结果显示，core/shell-DOTAP在结肠和MLNs中的相对分布最高，其次为core/shell-S100和core/shell-EPG，core/shell-MC3最低。MC3组分布较低可能与其近中性表面电荷有利于肝脏蓄积有关——MC3是用于递送siRNA至肝脏的脂质纳米粒子的关键组分。
为阐明纳米粒子从腹腔向肠道黏膜侧转运的机制，研究使用DiD标记纳米粒子核心，经腹腔注射后5小时收集腹腔灌洗液进行流式细胞术分析（每组n=5）。结果显示，纳米粒子特别是核壳型可诱导腹腔内巨噬细胞（F4/80+）和B细胞（CD19+）比例显著下降，同时单核细胞（Ly6C+）比例明显增加。此外，超过50%的免疫细胞摄取了纳米粒子（DiD阳性），其中淋巴细胞对core/shell纳米粒子的摄取显著高于core纳米粒子。在注射后24小时，对结肠、脾脏和MLNs进行免疫荧光染色分析。结肠组织切片中可观察到纳米粒子荧光信号出现在黏膜侧，同时在黏膜下层和肌层也有少量信号检出，提示纳米粒子可能通过某种机制穿越肠壁。共定位分析显示，结肠中部分纳米粒子信号与树突状细胞（CD11c+）和巨噬细胞（F4/80+）共定位。MLNs中纳米粒子与T细胞（CD3+）呈现强共定位（Pearson相关系数>0.6），脾脏中core/shell纳米粒子与树突状细胞的共定位强于core纳米粒子。
采用C57BL/6小鼠（每组n=6）建立DSS诱导的急性溃疡性结肠炎模型：小鼠饮用含1.5%（w/v）DSS的水2天，随后更换为3%（w/v）DSS水继续5天。在建模开始后第3、7、11天分别腹腔注射PBS（模型组）、游离FK506、FK506-core或FK506-core/shell（FK506剂量为1 mg/kg），第14天处死分析。结果显示，模型组小鼠出现进行性体重下降和结肠显著缩短。游离FK506部分缓解体重下降，而FK506纳米粒子特别是FK506-core/shell表现出更强的保护作用，只有FK506-core/shell能够显著改善DSS诱导的结肠缩短。炎症因子IL-2和TNF-α水平在模型组显著升高，各治疗组均有所降低，其中FK506-core/shell的总体效果最为显著。结肠组织H&E染色显示模型组和游离FK506组存在杯状细胞丢失、隐窝破坏和大量炎性细胞浸润，而两种纳米粒子组部分改善了组织结构完整性并抑制了炎症。髓过氧化物酶（MPO）免疫组化和CD4/CD8/干扰素-γ（IFN-γ）免疫荧光染色也证实FK506-core/shell的局部抗炎效果最优。肝肾功能相关血液生化指标和血液学参数分析未发现纳米粒子组存在明显毒性。
流式细胞术分析（每组n=6）显示，游离FK506、FK506-core和FK506-core/shell在MLNs中逐步降低CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的比例和绝对数量，同时增加CD4+调节性T细胞（Tregs）比例并降低IFN-γ水平。此外，游离FK506和FK506-core/shell均增加了PD-1+耗竭性CD8+ T细胞的比例。在脾脏中，仅游离FK506组表现出CD8+和CD4+ T细胞比例的显著降低以及Tregs比例的显著增加。游离FK506对IBD诱导的脾肿大的缓解效果最为显著。
研究首先通过纳米粒子表征证实了核壳结构的成功构建和表面电荷的显著改变。FK506-core/shell具有阳离子表面（+37.9 mV），有利于与带负电的细胞膜相互作用，增强组织黏附和细胞摄取。体外实验证实核壳结构提高了包封率和细胞摄取效率，为后续体内研究奠定了基础。
体内生物分布实验揭示了不同给药途径的差异：腹腔注射在结肠靶向方面具有独特优势，且核壳结构进一步增强了结肠蓄积（24.4% vs 10.2%）。同时，腹腔注射实现了MLNs的引流，而MLNs在肠道免疫调节中发挥关键作用。这些发现支持选择腹腔注射作为后续研究的给药途径。壳层组成优化实验进一步确认了DOTAP阳离子脂质在结肠和MLNs靶向中的优越性。
腹腔免疫细胞分析为理解纳米粒子的转运机制提供了重要线索：纳米粒子被腹腔内抗原提呈细胞（特别是巨噬细胞和B细胞）高效摄取后，可能通过细胞介导的主动转运（如“搭便车”机制）穿越肠壁到达黏膜侧，或通过淋巴引流进入MLNs和脾脏。组织免疫荧光证实了纳米粒子在结肠黏膜侧、MLNs和脾脏内的存在，且与不同类型免疫细胞的共定位模式不同。这些结果共同支持了纳米粒子通过被动引流和/或腹腔免疫细胞主动转运实现结肠靶向和全身免疫调节的假设。
DSS结肠炎模型中的治疗效果验证了上述机制的功能意义：FK506-core/shell通过改善结肠结构完整性、降低局部和全身炎症因子水平、重塑MLNs中的T细胞免疫格局（抑制效应T细胞、促进调节性T细胞和耗竭性T细胞）实现了最优的治疗效果。安全性评估进一步支持了该纳米治疗策略的转化潜力。
本研究系统证明了腹腔注射FK506-core/shell纳米粒子可通过被动引流和免疫细胞介导的主动转运机制实现结肠、MLNs和脾脏的有效蓄积与组织穿透。在DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型中，该治疗策略显著改善了全身性和局部肠道炎症，实现了有效的免疫抑制和免疫耐受诱导，且未引发可检测的肝肾或血液学毒性。
本研究的科学价值在于：首次系统阐明了腹腔注射纳米粒子治疗IBD的可行性及其作用模式，揭示了免疫细胞在纳米粒子转运中的“拦截器”和“运输载体”双重角色，为肠外给药策略在IBD治疗中的应用提供了实验依据和机制解释。在应用价值方面，该研究提出的核壳纳米平台可作为IBD靶向递药系统的设计基础，通过优化壳层组成实现结肠靶向效率的提升，有望克服现有IBD治疗中药物靶向性不足、生物利用度低和不良反应等问题。
本研究的主要亮点包括：（1）系统比较了三种肠外给药途径（静脉、腹腔、皮下）的纳米粒子生物分布差异，明确了腹腔注射在结肠靶向中的独特优势；（2）通过流式细胞术和组织免疫荧光多维度证据揭示了免疫细胞介导的纳米粒子转运机制，特别是纳米粒子从腹腔浆膜侧向肠道黏膜侧的跨壁转运现象；（3）证实了核壳结构对纳米粒子体内行为的显著影响，阳离子脂质壳层（DOTAP）可同时增强结肠蓄积和MLNs引流；（4）在治疗层面实现了MLNs免疫重塑与局部结肠抗炎效果的协同，且未产生系统性毒性，展示了良好的临床转化前景。