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单细胞RNA测序揭示先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease, HSCR）无神经节结肠段神经元分化缺陷

作者及机构
本研究由Szabolcs Tarapcsak、Xiaomeng Huang（共同一作）等来自美国犹他大学人类遗传学研究所（Eccles Institute of Human Genetics）的团队完成，Gabor T. Marth为通讯作者。论文于2025年7月预印发布于biorxiv平台（DOI:10.¹¹⁰¹⁄₂₀₂₅.07.01.662516）。

学术背景
先天性巨结肠（HSCR）是一种发病率1/5000的先天性肠神经系统（enteric nervous system, ENS）发育障碍，特征为远端结肠缺乏神经节细胞，导致功能性肠梗阻。尽管已知RET等基因突变与HSCR相关，但30%病例的遗传机制不明，且术后患者仍存在持续肠道功能障碍。传统观点认为ENS前体细胞（enteric neural crest derived cells, ENCCs）迁移障碍是主因，但近年研究发现微环境转录组变化可能同样关键。本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合全基因组测序（WGS）系统比较HSCR患者健康与无神经节结肠段的细胞组成与分子特征，旨在揭示神经分化阻滞的机制。

研究流程与方法
1. 样本收集与处理
- 从3例短段型HSCR患者手术切除标本中分离健康（近端）与无神经节（远端）结肠组织，同步采集血液对照。
- 组织经机械破碎与酶解（dispase/collagenase混合酶）后，通过微流控芯片（10x Genomics Chromium系统）构建单细胞文库，Illumina NovaSeq平台进行测序（深度约20,490细胞，其中健康结肠7,647个，无神经节结肠12,843个）。

1. 单细胞数据分析

   • 采用Seurat软件包进行质控（剔除线粒体基因占比>25%或UMI数<700/＞15,000的细胞），使用sctransform标准化。
     
   • 通过UMAP降维和Louvain聚类（分辨率0.5）鉴定13种主要细胞类型，依据标记基因（如神经前体细胞标记NGFR、成熟神经元标记TUBB3）注释细胞群体。
     
   • 差异表达分析采用Wilcoxon秩和检验（阈值：logFC>0.25，调整p值<0.05）。

2. 全基因组测序分析

   • 对匹配的结肠组织与血液样本进行60X深度WGS（Illumina NovaSeq 6000），使用FreeBayes检测体细胞变异，Facets算法分析拷贝数变异（CNV）。
     
   • 重点关注已知HSCR相关基因（RET、EDNRB等）及分化通路基因（Notch、BMP等）的变异。

3. 实验验证

   • 免疫荧光染色检测神经前体细胞标记物p75（NGFR编码）在组织中的分布，使用Zeiss 700共聚焦显微镜成像。

主要结果
1. 无神经节结肠存在神经前体细胞但缺乏成熟神经元
- scRNA-seq显示无神经节结肠中成熟神经元比例降至0%（健康结肠0.17%，p<0.0001），但神经前体细胞（NGFR+）仍保留（健康区0.65% vs 无神经节区0.45%，p=0.1049）。免疫荧光证实p75+细胞在两区域均存在（图2d）。
- 前体细胞中Notch（NOTCH1/3）、SHH（PTCH1/SMO）等分化通路受体基因表达显著下调（图2e），提示分化阻滞的分子基础。

1. 微环境转录组异常

   • 肥大细胞中IL1RL1（调控激活）、SOCS1（抑制信号）等基因下调，可能影响其通过神经营养因子（如NGF）促进神经分化的功能（图3f）。
     
   • 上皮细胞脂肪酸结合蛋白FABP1（参与脂代谢与炎症调控）表达降低，平滑肌细胞中骨架蛋白desmin（DES）减少，与既往HSCR组织学研究一致（表1）。

2. 体细胞变异作用有限

   • WGS发现RET、DHCR7等基因存在已知致病性胚系突变，但无神经节结肠特异性体细胞突变仅有少量低频率变异（如转录因子TEAD4结合位点突变）（图4b-c）。CNV分析未发现显著差异（图4d）。

结论与意义
本研究首次通过scRNA-seq揭示HSCR无神经节结肠区存在滞留的神经前体细胞，其分化障碍与微环境转录失调（如肥大细胞功能异常）及分化通路受体表达减少相关，而非单纯迁移缺陷。这一发现为HSCR的机制提供了新见解：
- 科学价值：挑战了传统”迁移缺陷”理论，提出”微环境-前体细胞交互障碍”新假说。
- 应用价值：无神经节结肠中残留前体细胞的发现，为自体移植治疗或原位神经再生疗法提供潜在靶点。

研究亮点
1. 技术创新：首次对HSCR患者配对的健康与病变结肠开展单细胞分辨率转录组比较，结合WGS多组学分析。
2. 概念突破：证实神经前体细胞迁移能力保留但分化受阻，提出微环境调控异常的关键作用。
3. 临床启示：鉴定出FABP1、IL1RL1等新的潜在干预靶点，为改善术后肠道功能提供方向。

其他价值
研究数据已开源（GitLab仓库），包含差异表达基因列表与变异注释，可作为HSCR研究的重要资源。团队开发的变异分析流程（整合FreeBayes-SnpEff-FACETS）适用于低频率体细胞突变检测。