关于一种工程化人源血脑屏障微流控模型用于血管通透性分析的协议报告
作者、机构与发表信息 本研究的主要作者包括 Cynthia Hajal, Giovanni S. Offeddu, Yoojin Shin, Shun Zhang, Olga Morozova, Dean Hickman, Charles G. Knutson 和 Roger D. Kamm。作者单位分别为麻省理工学院机械工程系、麻省理工学院生物工程系、哈佛大学分子与细胞生物学系以及 Amgen 公司研究部门。该研究以协议（Protocol）的形式发表于 Nature Protocols 期刊，2022年1月，第17卷，第95-128页。
学术背景 本研究属于生物医学工程和神经科学交叉领域，聚焦于体外血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）模型的构建与应用。血脑屏障是保护大脑免受血液中有害物质侵害的关键结构，但也严重限制了治疗神经系统疾病的药物分子进入脑实质。由于动物模型的结果在向临床转化时面临巨大挑战，因此迫切需要能够准确模拟人体BBB生理病理特征的相关体外模型，以研究分子转运机制并辅助药物设计。
传统的体外BBB模型，如二维（2D）内皮细胞单层共培养模型，虽然操作简单，但无法重现BBB在体内的三维（3D）细胞组织结构（内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的相互作用）和形态特征，其测得的分子通透性值通常比体内值高1-3个数量级，临床相关性有限。近年来发展的3D管状血管模型在结构和功能上仍存在不足，例如血管直径非生理性、通透性值仍偏高。因此，开发一种能够更真实地模拟人体BBB的3D、可灌注、且具有生理相关性通透性的体外模型，对于基础研究和药物开发具有重大意义。
本研究旨在提供一个详细、可重复的实验协议，用于在微流控芯片内自组装构建一个包含人多能干细胞来源或原代脑微血管内皮细胞、原代脑周细胞和星形胶质细胞的3D人源BBB微血管网络模型，并建立两种定量测量该模型中任何分子通透性的方法。该模型的目标是具备与体内相似的细胞组织形态、基因表达谱以及生理范围内的低分子通透性，从而成为学术和工业实验室中广泛使用的强大工具。
详细工作流程 本协议包含四个主要模块：微流控器件制备与BBB微血管网络形成、血管通透性测量、蛋白质与细胞结构成像、以及用于基因/蛋白质分析的细胞收集。整个流程从器件制备到下游分析约需13.5天。
第一模块：器件制备与BBB微血管网络形成（步骤1-20） 1. 器件设计与制备：协议提供了两种微流控器件设计：“微型器件”和“大型器件”。两者均具有一个中央凝胶通道和两个相邻的培养基通道。微型器件通过微柱阵列定义通道，便于表面张力辅助的凝胶填充；大型器件则通过更高的腔室和部分隔离墙实现连续的凝胶-培养基界面。器件使用聚二甲基硅氧烷通过标准软光刻或3D打印模具铸造而成，经等离子体处理与玻璃盖片键合、灭菌后，在烘箱中恢复疏水性。 2. 细胞准备与接种：使用人多能干细胞来源的内皮细胞或原代人脑微血管内皮细胞，与原代人脑周细胞和星形胶质细胞共培养。细胞在含有纤维蛋白原和凝血酶的混合凝胶中重悬。将细胞-凝胶混合物快速注入器件的中央通道，在37°C下聚合形成3D纤维蛋白凝胶基质，其中包裹着三种细胞。 3. 培养与微血管网络自组装：将器件置于培养箱中，使用添加了血管内皮生长因子的内皮细胞培养基培养。在培养过程中，内皮细胞会伸长、相互连接，并在7天内形成具有管腔的稳定微血管网络。同时，周细胞和星形胶质细胞会自发迁移并定位于新生血管周围，模拟体内BBB的细胞结构：周细胞包裹管腔，星形胶质细胞末端足接触血管壁外侧。 4. 内皮单层形成：为了在后续通透性实验中限制溶质从侧通道培养基直接扩散进入凝胶，在培养第4天，将额外的内皮细胞悬液加入侧通道，通过重力沉降使其附着在凝胶-培养基界面，形成一层连续的内皮细胞单层。该单层与中央凝胶内的微血管网络整合，增强了模型的屏障完整性。从第4天起，更换为不含额外血管内皮生长因子的常规培养基，继续培养至第7天，模型即可用于实验。
第二模块：血管通透性测量（步骤21-51） 该协议提供了两种互补的、高定量性的方法来测量BBB微血管网络对任何感兴趣分子的通透性，每种方法仅需约30分钟/器件。 1. 基于荧光信号共聚焦显微镜成像的通透性分析： * 原理：将待测分子（通常与荧光基团如FITC偶联）灌注到BBB微血管网络中。使用共聚焦显微镜在选定区域进行3D时间序列成像，捕获荧光分子从血管腔扩散到周围凝胶基质的过程。 * 图像采集：灌注后立即开始成像，在至少三个随机非重叠位置获取Z轴堆叠图像（建议Z间距5微米，总高度50微米）。根据分子量大小，在推荐的时间窗口（例如，小分子6分钟，大分子12分钟）后进行第二次成像。 * 数据分析：协议提供了基于ImageJ/Fiji的宏命令进行半自动图像分析。该宏处理图像堆栈，通过阈值分割区分血管腔和凝胶基质，计算两个时间点的平均荧光强度以及血管的表面积和体积等形态参数。 * 通透性计算：利用提供的公式，结合时间间隔、血管表面积、血管与基质间的荧光强度差以及基质内荧光强度的增加量，计算出通透系数P。该方法的优势在于能够空间分辨地测量局部通透性，并允许研究特定亚细胞区域的分子摄取（如共定位分析）。 2. 基于间质液收集与化学分析的通透性分析： * 原理：对BBB微血管网络施加生理性跨壁压力（如1 kPa），诱导产生跨内皮流体流动。流体会携带穿过血管壁的溶质分子穿过凝胶基质，并从凝胶注入端口流出，可被收集为“间质液”。 * 操作：将器件侧通道与压力调节器连接，施加压力后，从对侧端口按分钟收集流出的间质液，持续约10分钟。同时收集血管腔内的灌注液作为参考浓度。 * 样品分析：使用适合的分析技术（如荧光读板机、ELISA、质谱）测定间质液和灌注液中目标分子的浓度。 * 通透性计算：根据测得的间质液与灌注液浓度比值（C/C0），结合已知或假设的水力传导系数和反射系数，利用协议中提供的公式反算出通透系数P。此方法的优点是不需要对分子进行荧光标记，可直接测量原型药物分子，且适用于没有高级成像设备的实验室。
第三模块：蛋白质与细胞结构成像（步骤52-59） 为了验证模型的BBB特性并研究细胞间相互作用，协议描述了对整个器件或提取的凝胶进行免疫荧光染色的方法。 1. 固定与透化：使用4%多聚甲醛固定BBB模型，然后用Triton X-100进行透化处理。 2. 免疫荧光染色：利用跨膜压力差驱动抗体溶液在侧通道间流动，实现对3D凝胶内结构的有效染色。可以标记多种蛋白质，如内皮细胞连接蛋白（Claudin-5, ZO-1, VE-cadherin）、周细胞标志物（PDGFR-β）、星形胶质细胞标志物（GFAP）、基底膜成分（层粘连蛋白，IV型胶原）以及转运蛋白（如P-糖蛋白）。 3. 成像：对于微型器件，可直接进行高分辨率共聚焦显微镜3D成像。对于大型器件或需要更高分辨率时，可将凝胶从器件中取出，进行石蜡包埋和切片，然后进行染色和成像（如60倍油镜），甚至可用于电子显微镜观察。
第四模块：基因与蛋白质分析的细胞收集（步骤60-67） 为了在分子水平上表征BBB模型，协议描述了从3D凝胶中分离特定细胞类型（如内皮细胞）的方法。 1. 凝胶消化：使用Liberase酶消化含有微血管网络的纤维蛋白凝胶，释放出细胞。 2. 细胞分选：通过荧光激活细胞分选技术，利用内皮细胞特异性表面标志物（如CD31）分选出内皮细胞。 3. 下游分析：收集分选后的细胞，提取RNA或蛋白质，用于实时定量PCR分析BBB相关基因（如紧密连接蛋白、转运蛋白基因）的表达，或进行蛋白质印迹等蛋白质组学分析。这有助于将模型的表型（如通透性）与其分子特征相关联。
主要结果 1. 成功构建功能性BBB微血管网络模型：遵循该协议，能够在微流控器件中自组装形成3D的、可灌注的人源BBB微血管网络。免疫荧光染色证实了内皮细胞形成了连续的管状网络，周细胞紧密包裹血管，星形胶质细胞末端足与血管壁接触，重现了体内BBB的关键细胞结构。基因表达谱分析显示，模型中的内皮细胞表达了BBB特异性的连接蛋白和转运蛋白。 2. 重现生理性低通透性：该模型最关键的成果是其极低的血管通透性，与动物体内测量值处于同一数量级。例如，对于10 kDa葡聚糖，大鼠脑毛细血管通透性约为3.1 × 10⁻⁷ cm/s，而本BBB微血管网络模型测得值为1.7 × 10⁻⁷ cm/s；对于40 kDa葡聚糖，大鼠/小鼠体内值约为1.4–1.9 × 10⁻⁷ cm/s，模型值为4.2 × 10⁻⁸ cm/s。这显著优于传统的2D单层模型（通常高1-3个数量级）和现有的3D管状模型。 3. 两种通透性测量方法均有效且互补：基于成像的方法提供了高时空分辨率的通透性数据，并能可视化分子分布。基于间质液收集的方法则提供了无需标记的定量化学分析能力。两种方法测得的结果相互验证，表明该模型能可靠地定量评估不同大小和性质分子的跨BBB转运。 4. 模型具有高度可重复性和实用性：该协议标准化了操作流程，使得在不同实验室间重现成为可能。微流控器件尺寸小，显著减少了试剂和细胞消耗，降低了单个实验的成本，允许进行大量生物学重复。模型在培养第7天达到稳定，并可维持功能长达12-28天（取决于内皮细胞类型）。
结论与意义 本研究详细描述了一种在微流控芯片中构建高度仿生、功能完备的人源血脑屏障微血管网络模型的标准化协议。该模型成功模拟了BBB的3D细胞结构、分子表达谱和最关键的功能特性——生理性低通透性。其科学价值在于为研究BBB在生理和病理状态下的分子转运机制提供了一个强大、可靠且与人体相关的体外平台。应用价值体现在其作为药物研发的临床前筛选工具的巨大潜力，可用于评估治疗性分子（包括小分子、抗体、纳米颗粒等）穿透BBB的能力，并研究神经系统疾病（如阿尔茨海默病、脑肿瘤）中BBB功能障碍的机制。此外，使用人多能干细胞来源的内皮细胞为未来构建患者特异性的BBB模型用于个性化医疗奠定了基础。
研究亮点 1. 高度仿生的3D结构与功能：模型集成了BBB的所有主要细胞成分（内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞），并以3D方式自组装成微米级直径的血管网络，其通透性值首次在体外模型中达到了与体内相似的低水平。 2. 灵活且定量的双重通透性分析方案：协议提供了基于成像和基于流体收集的两种独立且互补的通透性测量方法，适应不同实验室的设备和研究需求，并确保了测量的准确性和定量性。 3. 标准化与可及性：协议步骤详尽，对关键步骤和常见问题提供了说明和解决方案。所需设备为细胞培养和成像的常规配置，部分步骤（如模具制作）可外包，降低了技术门槛，旨在促进该模型在学术界和工业界的广泛应用。 4. 多功能的集成平台：该模型不仅用于通透性测试，还可用于免疫荧光成像、基因/蛋白表达分析、研究细胞间相互作用、评估血流剪切应力的影响，并具有整合其他细胞类型（如神经元、免疫细胞、肿瘤细胞）以模拟疾病微环境的扩展潜力。
其他有价值的内容 协议还详细比较了该模型与传统2D单层模型、3D管状模型以及动物模型的优缺点，突出了其在重现生理通透性、区分跨细胞与旁细胞转运、以及成本效益方面的优势。同时，也客观讨论了模型的局限性，例如缺乏体内BBB的完整微环境（如免疫细胞、神经活动）以及无法进行长期灌注研究（因缺乏类淋巴清除机制）。针对这些局限，作者提出了可能的改进方向，如引入更多细胞类型或使用微流泵进行长期灌注。这些讨论为模型的进一步发展和应用提供了清晰的视角。