本研究由Simone Wahl、Alexander Drong、Benjamin Lehne、Marie Loh、William R. Scott等多位学者联合完成，主要通讯作者为John C. Chambers（伦敦帝国理工学院）、Harald Grallert（亥姆霍兹慕尼黑中心）和Jaspal S. Kooner（伦敦帝国理工学院）。论文发表于 Nature 期刊，2017年1月5日，第541卷，7635期，页码81–86，DOI为10.1038/nature20784。
一、学术背景
肥胖和超重影响全球约15亿人，是2型糖尿病（type-2 diabetes, T2D）、心血管疾病及相关代谢和炎症紊乱的主要危险因素。尽管肥胖导致临床后果的机制尚不完全清楚，但已有研究表明脂肪堆积可能影响DNA甲基化（DNA methylation）——一种基因表达和分子表型的关键调控机制。本研究旨在通过表观基因组关联研究（epigenome-wide association study, EWAS）系统性地探讨体质指数（body mass index, BMI）与DNA甲基化之间的关系，并进一步分析这种甲基化改变是肥胖的原因还是结果，以及其临床应用价值。
二、研究流程
研究设计包括发现阶段和复制阶段。发现阶段纳入5,387名来自EPICOR（n=514）、KORA（n=2,193）和LOLIPOP（n=2,680）三个队列的个体，涵盖欧洲裔（EPICOR、KORA）和印度裔（LOLIPOP）人群。DNA甲基化使用Illumina Infinium 450K人甲基化芯片对外周血基因组DNA进行定量分析。全血被选为分析组织，因为其是代谢活跃组织，在肥胖相关炎症和血管并发症中起关键作用，且广泛用于临床诊断。在发现阶段，对每个常染色体CpG位点进行线性回归分析，调整年龄、性别、吸烟状态、体力活动指数、饮酒量、前20个对照探针主成分（principal components, PCs）以及估计的白细胞比例。研究采用p×10⁻⁷作为表观基因组显著性阈值，以满足对466,186个常染色体标记的Bonferroni多重校正。结果通过逆方差Meta分析合并，并进行基因组控制校正。
发现阶段鉴定出278个与BMI相关的CpG位点（p×10⁻⁷），分布在207个基因座。每个基因座选取P值最低的CpG作为哨兵标记（sentinel marker），在独立的全血样本中进行复制测试（n=4,874）。此外，通过焦磷酸测序（pyrosequencing）在990名欧洲裔和1,720名印度裔中对4个位点进行了技术验证。研究进一步在分离的白细胞亚群（单核细胞、中性粒细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞，n=60）中验证了DNA甲基化与肥胖的关联，以排除细胞组成变化的影响。同时，在脂肪组织（n=542）、肝脏组织（n=55）以及纯化脂肪细胞（n=48）中验证了甲基化与BMI的关系。
研究还采用遗传关联和孟德尔随机化（Mendelian randomisation）方法探讨DNA甲基化与BMI之间的因果方向。具体包括：①以影响血液甲基化的顺式单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）作为工具变量，检验甲基化是否为BMI的原因；②以已知影响BMI的SNPs构建加权遗传风险评分（genetic risk score, GRS），检验BMI是否为甲基化的原因。在脂肪组织中也进行了类似的因果分析。此外，研究进行了功能基因组分析，包括基因组注释富集分析、甲基化与基因表达关联分析（血液n=1,785；脂肪n=499；肝脏样本也进行了部分分析），以及候选基因和基因集富集分析。最后，研究评估了187个哨兵CpG位点与代谢性状（n=2,462）及新发T2D（n=2,664）的关联，并构建了甲基化风险评分（methylation risk score, MRS）来预测未来T2D风险。
三、主要结果
在发现阶段鉴定出的207个基因座中，187个哨兵CpG标记在独立复制样本中成功复制（p<0.05且方向一致，联合分析达到表观基因组显著性）。效应量范围为每单位甲基化变化（0–1尺度，1代表100%甲基化）对应BMI变化6.3±0.9至40.2±3.1 kg/m²，欧洲裔和印度裔之间异质性很小。敏感性分析表明，结果对分析策略选择稳健，不受DNA序列变异引起的群体分层或探针序列中SNP的遗传混杂影响。焦磷酸测序验证了4个位点的甲基化与BMI关联（p=1.2×10⁻⁷至2.1×10⁻¹²）。
187个甲基化标记显著富集于中间甲基化水平（20%–80%）的CpG位点（p=1.4×10⁻²²，Fisher检验），提示这些位点存在表观遗传异质性。在分离的白细胞亚群中，大多数位点表现出中间甲基化，且哨兵标记与肥胖的关联在四种细胞亚群中方向一致（CD4+ T细胞中130个位点方向一致，p=1.2×10⁻⁹；中性粒细胞中166个位点方向一致，p=5.6×10⁻³⁵，符号检验），效应量大小相似。这表明DNA甲基化与BMI的关联反映的是已定型细胞亚群内的表观遗传重编程，而非细胞亚群比例的变化。
在脂肪组织中，120个CpG位点与BMI的关联方向与血液中一致（p=1.3×10⁻⁴，二项检验），91个位点在脂肪组织中达到Bonferroni校正后显著性（p<2.7×10⁻⁴）。主成分分析表明，脂肪组织细胞组成混杂对结果影响很小。在纯化脂肪细胞中，尽管样本量较小，仍有6个哨兵标记与肥胖相关（p<2.7×10⁻⁴），108个标记方向一致（p=0.04）。肝脏组织中114个CpG位点与BMI关联方向与血液一致（p=0.001，符号检验）。跨组织比较显示，187个位点在不同组织间的平均甲基化水平呈中度至强相关（r=0.37至0.93）。
孟德尔随机化分析显示，仅有一个CpG位点（cg26663590：NFATC2IP）具有遗传学证据支持甲基化对BMI的因果作用（SNP rs11150675与BMI关联p=9.6×10⁻⁷），且该位点基线甲基化水平可预测纵向人群研究中的体重增加（p=0.03）。相反，BMI GRS预测的甲基化效应与直接观察到的效应高度相关（r²=0.65，p=4.7×10⁻⁴⁴），其中ABCG1、KLHL18、FTH1P20位点达到Bonferroni校正后显著性（p<2.7×10⁻⁴）。脂肪组织中的因果分析同样支持甲基化改变主要是肥胖的结果（r=0.73，p=1.6×10⁻³²）。这些结果强烈表明，在大多数鉴定出的CpG位点上，肥胖决定了甲基化的改变，而非甲基化导致肥胖。
功能基因组分析显示，187个CpG位点显著富集在活性染色质区域，包括DNase I超敏感位点和激活型组蛋白标记H3K4me1和H3K27ac（p<0.05），提示这些甲基化变化发生在跨组织发挥作用的组成性顺式调控区域。甲基化与基因表达关联分析发现38个注释基因的44个转录本与甲基化显著相关（p<9.0×10⁻⁶），相对于零假设富集约3倍（p=3.0×10⁻⁴）。最强的顺式信号包括cg09315878与TNFRSF4转录（p=7.2×10⁻⁸⁶）、cg14476101与PHGDH转录（p=1.0×10⁻⁶⁴）和cg09152259与MAP3K2转录（p=1.6×10⁻⁶⁷）。平均5%的绝对甲基化变化对应基因表达7%的变化。在38个甲基化-基因表达关联中，3个在脂肪组织中复制（HOXA5、BBS2、SELM），3个在肝脏中复制（ANXA1、LGALS3BP、PHGDH），方向均一致。
研究根据邻近性和功能基因组学标准确定了210个候选基因，许多基因在脂肪组织生物学和胰岛素抵抗中具有已知作用（如ABCG1、LPIN1、HOXA5、LMNA、CPT1A、SOCS3、SREBF1、PHGDH）。基因集富集分析显示，这些基因富集于脂质和脂蛋白代谢、氨基酸和小分子转运以及涉及NFκB、MAPK、TAK1、IRAK2和TRAF6的炎症通路。
在临床关联分析中，879对甲基化-临床性状关联达到Bonferroni校正后显著性（p<2.1×10⁻⁵）。孟德尔随机化分析表明，甲基化改变可能是BMI相关脂质和糖代谢变化的结果。在新发T2D预测方面，187个标记中有62个与T2D相关（p<2.7×10⁻⁴），其中ABCG1位点关联最强。甲基化风险评分（MRS）对T2D有很强的预测能力（相对风险2.29，95% CI 2.06–2.55，p=4.2×10⁻⁵²），并在KORA研究的欧洲人中成功复制（相对风险2.51，95% CI 1.49–4.23，p=5.7×10⁻⁴）。MRS在调整BMI和腰臀比等传统危险因素后仍能预测T2D，并且可以在肥胖和超重个体中识别出未来T2D高风险人群（肥胖个体中最高四分位与最低四分位相比，T2D相对风险为7.3，p=8.2×10⁻¹²）。
四、结论与意义
本研究首次通过大规模表观基因组关联研究系统地鉴定并复制了与BMI相关的187个DNA甲基化位点。这些甲基化改变主要发生在活性顺式调控区域，与脂质代谢、炎症和物质转运等通路相关。因果分析表明，这些甲基化改变绝大多数是肥胖的结果而非原因。甲基化风险评分能够独立于传统危险因素预测未来T2D的发生，尤其在识别代谢不良型肥胖方面具有潜在临床应用价值。该研究为肥胖相关代谢和心血管疾病的调控通路提供了新的见解，并可能为T2D的风险分层和个体化预防策略提供新的生物标志物。
五、研究亮点
本研究的亮点包括：①首次在超过一万人的多样本人群中系统绘制肥胖相关DNA甲基化图谱，并在独立样本、不同组织及纯化细胞亚群中验证；②采用孟德尔随机化方法明确甲基化改变与肥胖之间的因果方向；③发现甲基化改变具有跨组织共享的调控特征，同时存在组织特异性效应；④构建的甲基化风险评分对T2D表现出优于部分传统危险因素的预测价值，为临床应用提供了新的可能性。