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颞下颌关节骨关节炎（TMJOA）治疗新靶点：嗜酸性粒细胞通过Lumican-Anxa1轴抑制TGF-β通路缓解软骨退变的机制研究
颞下颌关节紊乱病（Temporomandibular Disorder, TMD）是全球范围内最常见的肌肉骨骼疾病之一，其中颞下颌关节骨关节炎（Temporomandibular Joint Osteoarthritis, TMJOA）是其最严重的形式，以进行性软骨降解、滑膜炎和骨赘形成为特征，严重影响患者的生活质量。传统治疗方法往往治标不治本。先天性免疫反应在TMJOA进展中至关重要，然而，作为先天性免疫细胞之一的嗜酸性粒细胞（Eosinophils, Eos）在TMJOA中的作用和机制尚不明确。
本项研究由Wenqian Chen, Yuwei Zhou 等人组成的团队主导，研究单位主要为福建医科大学口腔医学院及附属口腔医院、福建省口腔疾病研究重点实验室等。该研究成果以题为《Eosinophils-induced lumican secretion by synovial fibroblasts alleviates cartilage degradation via the TGF-β pathway mediated by Anxa1 binding》发表于学术期刊《Advanced Science》的2025年第12卷第2416030期。
学术背景与研究目的 TMJOA是一种区别于类风湿关节炎的退行性关节疾病，其关节软骨为纤维软骨，且在髁突表面存在独特的纤维软骨干细胞，这些特点决定了其病理机制和修复过程与承重关节不同。近年研究发现，免疫细胞在OA的滑膜微环境中扮演重要角色，但研究多集中于巨噬细胞，对嗜酸性粒细胞的关注不足。嗜酸性粒细胞传统上被视为过敏性疾病的效应细胞，但新证据表明其具有免疫调节、促进组织修复等功能。临床观察发现，健康人群颞下颌关节滑液中的嗜酸性粒细胞数量显著高于TMJOA患者，这提示嗜酸性粒细胞可能对关节稳态具有保护作用。基于此，本研究旨在阐明嗜酸性粒细胞在TMJOA进展中的具体作用及其分子机制，以期发现新的治疗靶点。
详细研究流程 本研究采用了临床观察、体内动物模型和体外细胞共培养系统相结合的多层次研究策略。
临床样本分析：
- 研究对象与样本量：研究收集了健康人群（n=13，用于VAS评分；n=13，用于功能障碍指数DI分析；n=6，用于嗜酸性粒细胞计数；n=7，用于ELISA检测）和TMJOA患者（n=20，用于VAS；n=24，用于DI；n=9，用于计数；n=18，用于ELISA）的颞下颌关节滑液、锥形束CT影像、疼痛视觉模拟评分（VAS）和Helkimo临床功能障碍指数数据。
- 处理方法与实验：使用全自动血细胞分析仪计数滑液中的嗜酸性粒细胞比例；采用酶联免疫吸附测定检测滑液中嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白（Eosinophil Major Basic Protein, EMBP）的水平；分析EMBP水平与DI值的相关性。
体内动物模型建立与表型验证：
- 研究对象：SD大鼠。
- 实验分组与处理：建立了三个核心模型。模型一（OVA诱导嗜酸性粒细胞增多）：通过卵清蛋白（Ovalbumin, OVA）致敏和激发，建立高嗜酸性粒细胞血症的哮喘大鼠模型。模型二（TMJOA诱导）：通过颞下颌关节腔内注射碘乙酸钠（Monosodium iodoacetate, MIA）建立TMJOA大鼠模型。模型三（嗜酸性粒细胞耗竭）：使用抗IL-5中和抗体（TRFK5）在OVA诱导的基础上耗竭嗜酸性粒细胞，对照组使用同型IgG。
- 处理方法与实验：研究者设置了Sham组、MIA组、OVA+MIA组、OVA+MIA+IgG组和OVA+MIA+TRFK组。通过吉姆萨染色和流式细胞术验证OVA诱导后肺部、血液及滑膜中嗜酸性粒细胞数量的增加，以及TRFK5的有效耗竭作用。通过颞下颌关节组织切片进行苏木精-伊红染色、番红O-固绿染色、甲苯胺蓝染色评估滑膜增生、炎症和软骨降解情况，并进行组织病理学评分（如滑膜评分、OARSI评分）。通过免疫荧光染色检测滑膜和软骨中MMP13、Aggrecan的表达。通过qRT-PCR检测滑膜和软骨组织中炎症、降解及修复相关基因（如MMP13、TNF-α、ADAMTS5、IL-10、Aggrecan、Col2a1等）的mRNA水平。通过蛋白质印迹法检测软骨和滑膜组织中关键蛋白（如COL2A1、MMP13、TNF-α、Lumican等）的表达。通过微型计算机断层扫描分析髁突软骨下骨的微观结构（如骨体积分数BV/TV、骨小梁厚度Tb.Th、骨密度等）。通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色和钙黄绿素/茜素红双标染色评估软骨下骨中破骨细胞数量和骨形成速率。
分子机制探索（RNA测序与生物信息学分析）：
- 研究对象：从Sham组、MIA组、OVA+MIA组大鼠中分离的滑膜组织。
- 处理方法与实验：对三组滑膜组织进行RNA测序，筛选差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。通过基因本体论和京都基因与基因组百科全书通路富集分析，确定嗜酸性粒细胞影响的潜在关键通路。利用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络，筛选枢纽基因。
体外细胞共培养系统验证机制：
- 研究对象：体外分离培养的大鼠下颌骨髁突软骨细胞、滑膜成纤维细胞以及骨髓来源的嗜酸性粒细胞。
- 处理方法与实验：
- 软骨细胞直接刺激：用重组大鼠Lumican蛋白或滑膜成纤维细胞的条件培养基处理IL-1β诱导的炎症软骨细胞，检测软骨基质蛋白（Aggrecan, COL2A1）和降解酶（MMP13）的表达变化。
- 滑膜-软骨细胞间接共培养：用嗜酸性粒细胞上清液或裂解液预处理滑膜成纤维细胞，然后收集其条件培养基处理软骨细胞，观察对软骨细胞表型的影响。
- 基因沉默：使用小干扰RNA在滑膜成纤维细胞中敲低Lumican，在软骨细胞中敲低Anxa1，验证其在上述共培养体系中的作用。
- 信号通路检测：通过蛋白质印迹法检测TGF-β2蛋白表达及Smad2/3的磷酸化水平。
- 蛋白质相互作用验证：对IL-1β处理的软骨细胞膜蛋白进行免疫共沉淀实验，使用His标签的重组Lumican蛋白作为诱饵，通过银染色和液相色谱-串联质谱技术筛选与Lumican相互作用的蛋白。利用AlphaFold3软件预测Lumican与候选蛋白（Anxa1）的相互作用模型，并分析结合能和关键氨基酸残基。
- ELISA检测：检测滑膜成纤维细胞条件培养基中Lumican的分泌量。
主要研究结果 1. 临床证据：TMJOA患者滑液中的嗜酸性粒细胞计数和EMBP水平均显著低于健康对照组。EMBP水平与患者的临床功能障碍指数呈弱负相关，提示嗜酸性粒细胞可能具有保护作用。
嗜酸性粒细胞在体内缓解TMJOA：
- OVA诱导的哮喘（高嗜酸性粒细胞状态）能显著减轻MIA诱导的TMJOA大鼠的滑膜增生、血管扩张和炎症细胞浸润，降低滑膜中MMP13的表达，提高抗炎因子IL-10的水平。
- 在软骨层面，OVA治疗减少了软骨降解，提高了软骨厚度和蛋白聚糖含量，下调了MMP13、TNF-α等分解代谢基因的表达，上调了Col2a1的表达。
- 在软骨下骨层面，OVA治疗改善了髁突的骨微观结构，增加了骨小梁厚度和骨密度，减少了破骨细胞数量，提高了骨形成速率。
嗜酸性粒细胞耗竭加剧TMJOA：使用TRFK5抗体耗竭嗜酸性粒细胞后，上述OVA带来的保护作用被逆转甚至恶化。耗竭组大鼠表现出更严重的滑膜炎症、软骨基质丢失、OARSI评分升高，以及更显著的软骨下骨破坏和骨小梁结构退化，直接证明嗜酸性粒细胞是缓解TMJOA的关键效应细胞。
机制探索：嗜酸性粒细胞通过上调滑膜Lumican抑制TGF-β通路：
- RNA测序分析发现，OVA+MIA组与MIA组相比，差异基因显著富集于“细胞外基质组织”和“TGF-β信号通路”。蛋白互作网络分析将Lumican确定为枢纽蛋白。
- 体内实验证实，OVA诱导后，滑膜组织中Lumican的mRNA和蛋白表达均显著上调，同时TGF-β2的表达和Smad2/3的磷酸化水平被抑制。而耗竭嗜酸性粒细胞后，Lumican的上调被削弱，TGF-β2表达回升。
- 体外实验证明，敲低滑膜成纤维细胞中的Lumican，会导致其条件培养基促进软骨细胞TGF-β2表达和Smad2/3磷酸化，并加剧软骨降解标记物（MMP13）的上调及基质蛋白（Aggrecan）的下调。外源性添加Lumican可逆转这一效应。
机制深化：Lumican通过与Anxa1结合抑制软骨TGF-β/Smad通路：
- 免疫共沉淀结合质谱分析鉴定出24个可能与Lumican相互作用的差异表达蛋白，其中膜联蛋白A1（Annexin A1, Anxa1）被列为候选。
- AlphaFold3预测模型显示，Lumican与Anxa1具有较高的结合可能性，预测的结合能为-69.70 kcal mol⁻¹，并揭示了潜在的相互作用氨基酸残基。
- 功能验证实验表明，在软骨细胞中敲低Anxa1，会导致TGF-β2表达和Smad2/3磷酸化水平升高，同时MMP13表达上调、Aggrecan表达下调。更重要的是，在Anxa1敲低的软骨细胞中，外源性Lumican无法有效抑制TGF-β2/Smad2/3信号通路，表明Anxa1是Lumican发挥保护作用所必需的结合受体。
研究结论与价值 本研究系统揭示了嗜酸性粒细胞在TMJOA中的保护性作用及其分子机制。结论为：健康关节滑液中存在的嗜酸性粒细胞能够促进颞下颌关节滑膜成纤维细胞分泌Lumican；分泌的Lumican作为关键信号分子，通过结合软骨细胞膜上的Anxa1，进而抑制软骨细胞内TGF-β2的表达及下游Smad2/3的磷酸化，最终减轻滑膜炎症、延缓软骨基质降解和抑制软骨下骨破坏。
科学价值： 1. 理论创新：首次阐明了嗜酸性粒细胞在颞下颌关节骨关节炎中的保护性角色及其详细的细胞与分子通路（嗜酸性粒细胞→滑膜成纤维细胞→Lumican→（通过结合Anxa1）软骨细胞→抑制TGF-β2/Smad2/3→缓解关节炎），填补了该领域的研究空白。 2. 靶点发现：鉴定出Lumican和Anxa1是TMJOA病理过程中滑膜-软骨交互作用的关键中介分子，为开发靶向治疗策略（如使用重组Lumican蛋白、调控Anxa1功能或模拟嗜酸性粒细胞的保护作用）提供了全新的潜在靶点。 3. 机制深化：揭示了TGF-β信号通路在TMJOA滑膜-软骨对话中的具体作用方式，并首次报道了Lumican通过结合Anxa1来调控该通路的崭新机制。 4. 转化潜力：研究提示，通过调节关节局部嗜酸性粒细胞的数量或功能、或直接补充Lumican，可能成为未来治疗TMJOA及其他骨关节炎疾病的新思路。
研究亮点 1. 研究设计系统严谨：结合临床观察、体内动物模型（增益与缺失功能模型）和体外多细胞共培养体系，从现象到机制进行了多层次、多角度的验证，证据链完整。 2. 机制研究深入创新：不仅发现了嗜酸性粒细胞-Lumican-TGF-β轴，更进一步利用免疫共沉淀、质谱和前沿的AlphaFold3蛋白结构预测技术，成功解析了Lumican在软骨细胞表面的作用受体Anxa1，将机制研究推进到了蛋白互作的结构层面。 3. 靶点新颖：Lumican和Anxa1在TMJOA中的作用此前未有报道，本研究为骨关节炎领域引入了全新的候选治疗靶点。 4. 临床相关性高：研究始于临床现象（患者滑液中Eos减少），最终回归于解释病理机制和寻找治疗靶点，具有很强的临床导向性和转化医学价值。
其他有价值的内容 研究还初步探讨了嗜酸性粒细胞颗粒蛋白EMBP与临床功能障碍的相关性，为后续研究嗜酸性粒细胞具体效应分子（如EMBP、EPX等）在TMJOA中的作用埋下了伏笔。此外，研究也简要对比了TMJOA与类风湿关节炎、TMJ纤维软骨与其他关节透明软骨的差异，强调了TMJOA研究的独特性和必要性。