研究报告：利用毕赤酵母高效分泌生产甜味蛋白Brazzein及其功能特性表征
一、研究概况
本研究由法国第戎味觉与食品科学中心（Centre des Sciences du Goût et de l’Alimentation）的Nicolas Poirier、Loïc Briand等人，与德国波茨坦-雷布吕克人类营养研究所（German Institute of Human Nutrition Potsdam-Rehbruecke）的Anne Brockhoff、Wolfgang Meyerhof等人合作完成。通讯作者为Loïc Briand。该研究成果于2012年发表在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》上。
二、研究背景与目的
Brazzein（brazzein）是一种分子量仅6.5 kDa的小型甜味蛋白，天然存在于西非植物Pentadiplandra brazzeana Baillon的果实中。该蛋白因具有极高的甜度（重量基准下为蔗糖的500至2000倍，分子数基准下为9500至38000倍）、高热稳定性、高pH稳定性、良好的水溶性以及纯正的甜味（无苦、酸、咸等杂味）等特点，被认为是极具潜力的天然高强度甜味剂，可应用于软饮料、糖浆、口香糖及药品等领域。
Brazzein天然存在两种形式：主要形式pGlu-Bra（约80%）的N端含有一个焦谷氨酸（pyroglutamic acid, pGlu）残基，共54个氨基酸；次要形式des-pGlu-Bra（约20%）则缺失该N端焦谷氨酸，为53个氨基酸。据报道，des-pGlu-Bra的甜度是pGlu-Bra的两倍。
由于从天然来源提取brazzein产量极低且困难重重，利用基因工程进行异源表达成为必然选择。然而，此前的大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统面临蛋白包涵体不可溶、需要复杂复性、融合标签难以去除且导致N端序列异常等问题；乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）系统则表达量极低且甜度不足；转基因玉米虽然产量可观，但作为研究工具其下游纯化流程复杂、得率低，限制了其应用。
本研究旨在利用甲基营养型酵母——毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统，高效生产具有正确N端序列和天然构象的可溶性brazzein，以克服现有表达系统的缺陷。同时，对所得重组蛋白进行全面的结构和功能表征，验证其与天然蛋白的等效性。
三、研究方法与工作流程
本研究的工作流程主要包括表达载体构建、毕赤酵母转化与筛选、高密度发酵与蛋白分泌、蛋白纯化、理化表征及功能验证等步骤。
1. 表达载体构建 研究者构建了两种毕赤酵母表达质粒。第一种质粒pPIC9-Bra用于表达在N端带有谷氨酰胺（Glutamine, Gln）残基的54个氨基酸的brazzein序列。选择在N端第一个位置引入Gln，是基于其侧链可自发发生环化反应，脱水形成焦谷氨酸，从而在分泌后生成天然的pGlu-Bra形式。同时，这一设计也意外产生了一种非天然存在的、N端为Gln的brazzein形式，研究者将其命名为Q1-Bra。第二种质粒pPIC9-Bra-delQ1是在前者的基础上，通过PCR定点突变（QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit, Stratagene）删除N端第一个谷氨酰胺的密码子，从而用于表达53个氨基酸的des-pGlu-Bra形式。 两种质粒均将目的基因插入到甲醇诱导型强启动子——醇氧化酶1（alcohol oxidase 1, AOX1）启动子下游，并融合了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的α-因子前导肽（α-factor mating prepropeptide）信号序列，以引导蛋白分泌至胞外。
2. 酵母转化、筛选与高密度发酵 通过电穿孔法将线性化的表达质粒整合至毕赤酵母GS115（his4）菌株的基因组中。筛选获得约300个组氨酸营养缺陷型恢复（His+）的转化子，并从中挑取了约50个具有甲醇利用缓慢（methanol utilization slow, MutS）表型的克隆。通过在缓冲型复合甘油培养基（BMGY）中培养，再转入缓冲型复合甲醇培养基（BMM，pH 6.0）中诱导2天，通过SDS-PAGE电泳筛选出分泌brazzein产量最高的克隆株。 对于最优克隆，在2升摇瓶规模下进行为期6天的甲醇诱导高密度发酵表达。发酵期间，每日两次补加甲醇以维持1%（v/v）的浓度。
3. 蛋白纯化 由于毕赤酵母本身分泌的背景蛋白极少，且brazzein直接从细胞分泌到基本盐培养基中，纯化流程极为简便。发酵上清液经离心和0.22 μm膜过滤澄清后，在pH 4.0的条件下进行透析。随后，使用SP-Sepharose阳离子交换层析柱进行一步纯化，使用20 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.0）结合蛋白，并用0到1 M的氯化钠线性梯度进行洗脱。监测275 nm波长的吸光度以检测无芳香族氨基酸色氨酸的brazzein。纯化结果通过SDS-PAGE鉴定。最终，pGlu-Bra、Q1-Bra和des-pGlu-Bra三种形式的纯化产量分别达到约90 mg/L、30 mg/L和90 mg/L。
4. 理化性质表征 通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）精确测定各蛋白形式的分子量。pGlu-Bra的测量分子量为6490.7 Da，与含焦谷氨酸和4对二硫键的理论质量（6490.3 Da）一致。Q1-Bra的分子量为6509.3 Da，与含N端谷氨酰胺和4对二硫键的理论质量相符，比pGlu-Bra多18 Da（即一个水分子的质量）。des-pGlu-Bra的分子量为6369.4 Da，完全符合缺失N端焦谷氨酸和谷氨酰胺的理论质量（6370.2 Da）。质谱结果证明了信号肽被精确切除，且二硫键完全形成。 通过一维氢核磁共振波谱（1H NMR）分析蛋白折叠状态。三种brazzein的谱图均在化学位移0.5 ppm以下出现高场尖锐的甲基/亚甲基峰，并在酰胺质子区域有良好的信号色散，这是蛋白质正确折叠的典型特征。
5. 功能特性表征——体外与体内实验 （1）体外受体活性实验： 利用稳定表达嵌合G蛋白亚基Gα16gust44的HEK293T细胞，瞬时共转染人源甜味受体亚基hT1R2和hT1R3。通过监测荧光钙离子指示剂Fluo-4 AM在自动加样系统FLIPR TETRA上的信号变化，记录不同浓度brazzein对受体的激活情况。通过拟合浓度-反应曲线，计算半数有效浓度（EC50）和最大反应幅度。仅使用空载体转染的模拟细胞作为阴性对照。 （2）体内感官评价： 在获得波茨坦大学伦理委员会批准后，招募24名健康志愿者，对三种brazzein形式和对照物蔗糖进行心理物理学测试。实验包括两部分：其一，通过4择1强制选择（4-AFC）法的12个浓度梯度系列测试，测定检测阈值和识别阈值，并使用逻辑回归模型拟合概率-浓度曲线；其二，使用通用标签量级尺度（gLMS）对六种不同浓度的样品及蔗糖对照进行甜味强度评分，绘制甜味强度-浓度心理测量曲线，并使用史蒂文斯幂律（Stevens’ power law）进行非线性回归拟合，计算与蔗糖等甜度的甜度倍数。
四、主要结果与分析
1. 蛋白表达与纯化结果 在甲醇诱导的第0至6天，SDS-PAGE电泳清晰显示培养基上清液中有一条迁移至约6.5 kDa的单一条带，其量随时间推移而积累。非转化酵母的培养上清无此条带，证明该蛋白为重组brazzein。对切除条带的MALDI-TOF鉴定确认为brazzein。利用阳离子交换层析实现了一步纯化。对pPIC9-Bra构建，洗脱图谱显示两个独立的峰：占总量约75%的前峰被鉴定为pGlu-Bra，而占约25%的后峰即为N端Gln未发生环化的中间产物Q1-Bra。这说明酵母分泌的Q1-Bra在培养基中自发地向pGlu-Bra转化，但未能彻底完成。pPIC9-Bra-delQ1构建的产物在更高离子强度下以单峰形式洗脱，为均一的des-pGlu-Bra。最终三种形式的蛋白纯度均超过95%。
2. 受体激活功能验证 钙成像实验表明，三种brazzein形式均能特异性地激活hT1R2/hT1R3受体，引起胞内钙离子浓度上升，而模拟细胞无任何反应，证实了重组蛋白的生物学活性。浓度-反应曲线显示，三种形式的效力极高且非常接近，其EC50值分别为：pGlu-Bra（0.055 ± 0.006 g/L）、Q1-Bra（0.066 ± 0.011 g/L）和des-pGlu-Bra（0.061 ± 0.005 g/L）。统计分析显示，三者的EC50无显著差异，尽管des-pGlu-Bra的反应曲线略有左移且最大信号幅度有稍高的趋势。这表明N端差异对受体的结合和激活能力影响甚微，体外实验结果支持了“N端结构并非与甜味受体相互作用的关键部位”的假说。与此相比，蔗糖激活同一受体的EC50约为25 mM，brazzein的活性高出数千倍。
3. 感官甜味特性分析 阈值测定结果显示，三种brazzein的检测阈值极低，在2.73-5.31 mg/L范围内，彼此无统计学差异，但远低于蔗糖的2.21 g/L。然而，识别阈值则出现显著差异：pGlu-Bra（8.90 mg/L）显著高于Q1-Bra（3.09 mg/L）和des-pGlu-Bra（3.07 mg/L），表明pGlu-Bra需要更高的浓度才能被明确感知为“甜味”，即其致甜能力较弱。 在超阈值强度的测试中，心理测量曲线显示，Q1-Bra和des-pGlu-Bra的甜味强度感知相似，而pGlu-Bra在高浓度范围（50 mg/L和100 mg/L）下被评价为甜度显著低于前两者。甜度倍数计算结果显示，在相当于20、50、100 g/L蔗糖甜味水平上，pGlu-Bra的甜度倍数为蔗糖的422-545倍，甜度最低；Q1-Bra为760-923倍，居中；des-pGlu-Bra为875-1568倍，甜度最高。尤其值得注意的是，在低浓度（20 g/L蔗糖等效点）时，des-pGlu-Bra的甜度（1568倍）是pGlu-Bra（422倍）的3.7倍。此结果与天然形式中des-pGlu-Bra甜度约为pGlu-Bra两倍的早期报道相符。体内感官实验揭示了N端残基对brazzein甜味强度的重要影响。
五、结论与研究价值
本研究成功建立了在毕赤酵母中高效表达并一步纯化分泌型brazzein的技术平台，首次同时获得了两种天然形式的、具有正确N末端和正确折叠构象的可溶性重组brazzein，以及一种高纯度的非天然中间形式Q1-Bra。结合体外受体活性检测和人体感官评价的双重功能验证，充分证明了重组蛋白与天然蛋白在结构和功能上具有高度等效性。
该研究的科学价值在于：（1）澄清了brazzein N末端对其甜味功能的影响，发现N端变异不影响受体结合力（EC50相似），但显著影响感官甜味强度（pGlu-Bra最弱，des-pGlu-Bra最强），提示N端可能在受体激活后的信号传导效率或口腔中的生物利用度上发挥作用；（2）为通过定点突变深入研究brazzein的结构-功能关系，特别是鉴定与甜味受体相互作用的关键氨基酸残基，提供了一个理想的平台。
其应用价值更为突出。毕赤酵母表达系统具备安全（GRAS）、高密度发酵、可规模化放大、蛋白直接分泌到低蛋白背景的最小培养基中从而极大简化纯化工艺等优点。本研究中des-pGlu-Bra高达90 mg/L的纯化产量，结合蛋白本身卓越的物化稳定性，为brazzein作为新一代天然高强度甜味剂的工业化生产扫清了主要障碍，铺平了道路。
六、研究亮点