本研究由来自巴西米纳斯吉拉斯联邦大学（Universidade Federal de Minas Gerais）的Graziele L. Negreiros-Lima、Kátia M. Lima、Isabella Z. Moreira等研究人员共同完成，其中Lirlândia P. Sousa为通讯作者。该研究成果于2020年1月6日发表在国际期刊《Cells》上。
一、 研究背景与目的
炎症消退是一个主动且高度调控的生物学过程，旨在恢复组织稳态。巨噬细胞作为炎症反应的核心调控者，其功能表型的转换对于炎症的消退至关重要。巨噬细胞大致可分为促炎的M1型（经典活化型）和抗炎促修复的M2型（替代活化型）及促消退型（Mres）。M1型巨噬细胞参与宿主防御，而M2和Mres型巨噬细胞则在炎症消退和组织重塑中发挥关键作用。巨噬细胞在不同微环境信号下，能够在不同表型之间进行重编程或再极化，这一特性是维持免疫稳态的基础，并为治疗慢性炎症性疾病提供了潜在靶点。
环磷酸腺苷（cAMP）是一种关键的细胞内第二信使，由其上游分子腺苷酸环化酶（adenylate cyclase, AC）催化三磷酸腺苷（ATP）生成，其水平受磷酸二酯酶（phosphodiesterases, PDEs）调控。已有研究表明，促消退介质如消退素（resolvin, Rv）D1、D2和膜联蛋白A1（annexin A1, AnxA1）的部分作用是通过激活cAMP信号通路介导的。尽管cAMP在炎症消退中的重要性已被认识，但其在消退过程中发挥功能的具体机制，特别是在调节巨噬细胞关键功能方面的作用，仍未完全阐明。因此，本研究旨在深入探究cAMP类似物二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP）对巨噬细胞在炎症消退背景下三项关键功能——非炎性招募（nonphlogistic recruitment）、表型重编程（reprogramming）和胞葬作用（efferocytosis）——的调控作用及潜在机制。
二、 研究工作流程与详细方法
本研究综合运用了体内动物模型和体外细胞实验来系统性地评估db-cAMP对巨噬细胞功能的影响，主要包含以下七个相互关联的研究步骤：
1. 体内白细胞趋化迁移实验 为探究cAMP能否诱导白细胞招募，研究者向BALB/c小鼠胸膜腔注射db-cAMP（4 mg/kg），在注射后4、24和48小时收集胸膜腔灌洗液。通过迈-格-姬（May-Grünwald-Giemsa）染色和细胞形态学标准进行总细胞及分类计数。为进一步确定被招募的白细胞亚群，在注射后48小时利用流式细胞术，通过特异性表面标志物来鉴定巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞。为探究作用机制，在注射db-cAMP前1小时，分别预先给予CCR2拮抗剂RS504393或PKA抑制剂H89，以评估CCL2/CCR2轴和cAMP经典效应蛋白PKA在其中的作用。同时，用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测胸膜腔灌洗液中IL-10、CXCL1、TNF-α和IL-6的水平，以验证该招募过程是否伴有炎症反应。
2. 巨噬细胞极化与重编程实验 在体外，研究者分离了BALB/c小鼠的骨髓，并利用含L929细胞条件培养基的完全培养基，将其分化为骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDMs）。用db-cAMP（100 μM）处理BMDMs 6、12和24小时后，采用实时定量PCR检测M2型标志物（如精氨酸酶-1（Arginase-1, Arg-1）、甘露糖受体CD206）和M1型标志物诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的基因表达水平，并用ELISA检测细胞培养上清液中IL-10、TGF-β和TNF-α的分泌水平。为验证PKA依赖性，用PKA抑制剂H89预处理BMDMs 1小时，再给予db-cAMP刺激，检测M2标志物的变化。为探究db-cAMP与经典M2诱导因子的协同作用，将BMDMs与IL-4单独或联合处理，通过蛋白质印迹法分析STAT3和STAT6的磷酸化水平，并通过qPCR检测Arg-1的表达。最后，为模拟体内炎症环境下的重编程，先用db-cAMP预处理BMDMs 1小时，再加入M1型刺激物IFN-γ和LPS，检测其对M1/M2标志物表达、促炎因子分泌及STAT1磷酸化的影响。
3. 体内巨噬细胞极化模型 研究者采用脂多糖（LPS）诱导的、可自行消退的胸膜炎模型。在炎症高峰期（LPS注射后8小时）给予db-cAMP治疗，在LPS注射后30小时收集胸膜腔细胞，利用多参数流式细胞术，根据F4/80、Gr1和CD11b的表达水平，区分并计数M1、M2和Mres三种巨噬细胞亚群的数量，并检测与胞葬作用相关的分子AnxA1和CD36在F4/80阳性巨噬细胞中的表达频率。
4. 体外胞葬作用分析 将BMDMs与用星形胞菌素诱导凋亡并经羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的人中性粒细胞，以1:3的比例共培养1小时。洗去未被吞噬的凋亡细胞后，用抗F4/80抗体标记巨噬细胞并进行流式细胞术分析。以F4/80阳性细胞群体中CFSE的平均荧光强度作为巨噬细胞吞噬能力的量化指标。为验证PKA依赖性，一组BMDMs在db-cAMP处理前用H89进行预处理。
5. 体内胞葬作用分析 采用酵母多糖诱导的腹膜炎模型。向BALB/c小鼠腹腔注射酵母多糖62小时后，给予db-cAMP治疗。7小时后，再向腹腔注射CFSE标记的凋亡人中性粒细胞。1小时后收集腹腔灌洗液，一方面通过流式细胞术分析F4/80和CFSE双阳性细胞的百分比及CFSE的平均荧光强度；另一方面，通过制作细胞离心涂片并进行迈-格-姬染色，在光学显微镜下进行形态学计数，直接观察并统计含有凋亡小体的巨噬细胞比例。
6. 内源性cAMP在炎症消退中的必要性验证 再次使用LPS诱导的自行消退性胸膜炎模型。在炎症高峰期（8小时）给予PKA抑制剂H89，并在24小时后计数胸膜腔中的中性粒细胞和单核细胞数。在另一组更长期的实验中，于LPS注射后8小时和24小时（加强剂量）两次给予H89，在48小时收集细胞计数，并根据中性粒细胞数量-时间曲线计算消退指数，包括消退期等关键参数，以评估抑制内源性cAMP/PKA通路对炎症自然消退进程的影响。
三、 主要研究结果
1. db-cAMP诱导非炎性单核细胞招募 结果显示，db-cAMP注射后，小鼠胸膜腔白细胞总数呈时间依赖性增加，在24和48小时达到峰值。这些被招募的细胞几乎全为单核细胞，而中性粒细胞数量无明显变化。机制上，该招募作用伴随着抗炎细胞因子IL-10水平的早期和持续性升高，而中性粒细胞趋化因子CXCL1及促炎因子TNF-α、IL-6水平无变化，证实了这是一种非炎性招募过程。流式分析进一步确认，招募的主要是Ly6C⁺F4/80⁻的单核细胞，且这些单核细胞表面CCR2的表达频率增加。同时，db-cAMP注射后4小时，胸膜腔内的CCL2水平即显著升高。预先使用CCR2拮抗剂RS504393或PKA抑制剂H89均能显著抑制db-cAMP诱导的单核细胞招募，表明该过程依赖于CCL2/CCR2信号轴和PKA活性。
2. db-cAMP促M2型极化并抑制M1型极化 在体外，db-cAMP处理BMDMs后，M2标志物Arg-1、CD206和Ym-1的基因表达显著上调，并伴有IL-10分泌水平的升高，而M1标志物iNOS仅被微弱诱导，TNF-α水平无显著改变。此极化效应可被PKA抑制剂H89所阻断。db-cAMP还能与IL-4产生协同作用，显著增强STAT3的磷酸化水平和Arg-1的表达。更重要的是，在IFN-γ和LPS存在的促炎环境下，db-cAMP预处理能有效阻止M1型极化，具体表现为抑制了STAT1的磷酸化，降低了TNF-α和IL-6的分泌，并上调了Arg-1的表达，从而将巨噬细胞的表型重编程为M2样表型。在体内，LPS诱导的胸膜炎模型中，db-cAMP治疗可显著减少胸膜腔中M1型巨噬细胞的数量，但对M2和Mres型巨噬细胞的数量无显著影响。
3. db-cAMP增强巨噬细胞胞葬作用 流式细胞术和形态学分析均证实，db-cAMP处理能显著增强BMDMs对凋亡中性粒细胞的胞葬作用，且该效应部分依赖于PKA活性（使用H89预处理可部分抑制）。在体内酵母多糖腹膜炎模型中，db-cAMP治疗同样显著提高了巨噬细胞对注射的凋亡中性粒细胞的吞噬能力，表现为F4/80⁺CFSE⁺双阳性细胞比例和CFSE荧光强度的增加。与此结果相一致，在LPS胸膜炎模型中，db-cAMP治疗显著增加了胸膜腔巨噬细胞表面与细胞识别和吞噬功能密切相关的分子——AnxA1和CD36的表达频率。
4. 内源性cAMP对生理性炎症消退至关重要 在LPS诱导的自行消退性胸膜炎模型中，使用H89抑制PKA后，炎症消退过程受到严重破坏。与对照组相比，H89处理组24小时时中性粒细胞数量持续较高，而单核细胞数量减少。通过计算消退指数发现，对照组炎症的消退期约为30小时，而H89处理组直到48小时观察终点，胸膜腔中仍有大量中性粒细胞浸润，未能进入消退期，预测其消退期将超过48小时。这一系列结果强有力地证明，内源性cAMP-PKA信号通路是驱动该模型炎症生理性消退的关键性内源机制。
四、 结论与研究价值
本研究系统性地揭示了cAMP作为细胞内信号枢纽，通过PKA依赖性途径，在调控巨噬细胞三项核心促消退功能中的关键作用：1）通过CCL2/CCR2轴非炎性地招募单核细胞至炎症部位；2）促进巨噬细胞向抗炎的M2表型重编程，并拮抗M1表型极化；3）上调吞噬相关分子并增强胞葬作用。本研究的科学价值在于，它将cAMP对单核/巨噬细胞的多种有益调节功能（招募、重编程、胞葬）整合为一个完整的促消退机制网络，深化了对炎症消退复杂调控过程的理解。其应用价值在于，为开发靶向cAMP信号通路（如PDE4抑制剂）来治疗以炎症消退障碍为特征的慢性自身免疫性或炎症性疾病（如类风湿关节炎、动脉粥样硬化等）提供了坚实的理论基础和新的药物干预靶点。
五、 研究亮点
本研究的主要亮点在于其系统性和完整性。首先，研究并非孤立地观察单个巨噬细胞功能，而是涵盖了从细胞招募、表型转化到最终清除凋亡细胞这一完整的促消退功能链。其次，发现了db-cAMP诱导的巨噬细胞呈现一种混合表型，即同时高表达M2标志物和具有杀菌功能的iNOS，这提示其可能在抗感染炎症的消退中具有独特优势。再次，研究提出了cAMP对单核细胞招募作用的“时相依赖性”假说，即在非炎症背景下激活CCL2/CCR2轴促进招募，而在高度炎症背景下则可能抑制CCL2以限制炎症，为cAMP的复杂免疫调节功能提供了新视角。最后，通过PKA抑制实验，不仅在体外验证了信号通路，更在体内模型中证实了内源性cAMP-PKA轴对生理性炎症消退的不可或缺性，极大地增强了结论的生理相关性和说服力。