MALDI-TOF MS与化学计量学方法鉴定醋酸钙不动杆菌-鲍曼不动杆菌复合群物种的研究

主要作者与研究机构

本研究由葡萄牙波尔图大学药学院REQUIMTE实验室的C. Sousa、J. Botelho、L. Silva、F. Grosso及L. Peixe等人完成，合作单位包括捷克布拉格国家公共卫生研究院细菌遗传学实验室的A. Nemec，以及葡萄牙里斯本大学药学院的J. Lopes。该研究发表于《International Journal of Medical Microbiology》（国际医学微生物学杂志）2014年第XXX卷，文章编号jmm 50822，页码1–9，于2014年1月15日投稿，2014年3月7日修回，2014年4月27日接受，由Elsevier GmbH出版。

研究背景

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）作为一种快速、低廉的细菌鉴定技术，已逐渐成为临床微生物实验室常规诊断中物种水平鉴定的首选方法。然而，对于亲缘关系极为密切的物种群，该技术仍面临显著挑战。醋酸钙不动杆菌-鲍曼不动杆菌复合群（Acinetobacter calcoaceticus–Acinetobacter baumannii complex，简称ACB复合群）包含六个基因种：鲍曼不动杆菌（A. baumannii）、医院不动杆菌（A. nosocomialis）、皮特不动杆菌（A. pittii）、醋酸钙不动杆菌（A. calcoaceticus）、基因种“近13TU”（gen. sp. “close to 13TU”）和基因种“1与3之间”（gen. sp. “between 1 and 3”）。其中鲍曼不动杆菌是最具临床意义的物种，常引起严重的院内感染，并呈现多重耐药表型，与高死亡率相关。近年来非鲍曼不动杆菌感染报道日益增多，且不同物种在抗菌药物敏感性和毒力特征上存在差异，因此精确鉴定ACB复合群内各物种具有重要的临床意义。

此前基于MALDI-TOF MS的ACB物种鉴定研究主要依赖与MALDI Biotyper数据库的直接比对或对厂商推荐流程的小幅修改，但错误鉴定率仍然较高。本研究旨在评估MALDI-TOF MS与化学计量学工具（偏最小二乘判别分析PLSDA和层次聚类分析HCA）相结合的方法，对ACB复合群六个物种进行准确区分的可行性，并比较完整细胞（intact cells，IC）与细胞提取物（cell extracts，CE）两种样品制备方式的效果。

研究流程

本研究纳入83株经过分类学充分鉴定、来自不同国家和时期临床标本的无关菌株，以最大程度反映ACB复合群已知的表型多样性。菌株组成如下：鲍曼不动杆菌28株、医院不动杆菌20株、皮特不动杆菌20株、醋酸钙不动杆菌9株、基因种“近13TU”4株、基因种“1与3之间”2株。所有菌株均经rpoB基因测序在物种水平上确认，多数还经多位点序列分型（MLST）或AFLP全基因组指纹图谱等分类学方法验证。菌株间的差异性通过多种基因分型方法证实。

MALDI-TOF MS实验采用完整细胞和细胞提取物两种方式平行进行。完整细胞取自Mueller-Hinton琼脂37°C培养18小时的过夜培养物。细胞提取物按照制造商说明制备：过夜培养物悬浮于HPLC级水中，以75%乙醇处理，离心去上清后，用25 μL 70%甲酸萃取，再加入25 μL乙腈，2000 rpm涡旋1分钟。完整细胞和细胞提取物样品均点样于MALDI磨砂钢靶板（AnchorChip），干燥后加1 μL化学基质（α-氰基-4-羟基肉桂酸在50%乙腈和2.5%三氟乙酸中的饱和溶液）。质谱在Microflex III仪器（Bruker Daltonics，德国不来梅）上以线性正离子模式随机盲法采集，氮气激光频率20 Hz，质量范围2–20 kDa，每张谱图由6组×40次单激光射击在不同位置累加而成。每个菌株进行四次仪器重复和至少两次生物学重复。使用大肠杆菌DH5α标准峰进行外部校准。

数据分析采用两种策略。首先将MALDI-TOF峰与MALDI Biotyper软件（版本3.0 build 25）内置参考谱库直接比对。其次进行化学计量学分析：利用MATLAB的PLS Toolbox中peakfind函数（参数：Savitzky–Golay滤波9点，峰容差6单位，局部最大值估计19点）生成每个菌株的平均谱图，通过PLSDA和HCA进行聚类分析。PLSDA模型中，每个已知样本被赋予一个在其物种对应位置为1、其余为0的向量，模型通过抽取潜变量（LV）从数据矩阵X（质谱）和Y（物种编码矩阵）中提取载荷与得分。模型采用留一法交叉验证以防止过拟合，并随机选取30%样本作为测试集重复100次评估灵敏度与特异度。HCA以PLSDA得分作为输入，使用k近邻凝聚法生成树状图。

主要研究结果

通过MALDI Biotyper数据库直接比对，完整细胞法鉴定结果为：所有28株鲍曼不动杆菌、20株皮特不动杆菌和9株醋酸钙不动杆菌均获正确鉴定；但20株医院不动杆菌中有2株被误判为鲍曼不动杆菌；4株基因种“近13TU”全部被误判为鲍曼不动杆菌；2株基因种“1与3之间”分别被误判为皮特不动杆菌和醋酸钙不动杆菌。所有物种的平均分值均未超过2.300，按制造商标准仅能达到“可能的物种水平鉴定”。细胞提取物法的结果更差：鲍曼不动杆菌和醋酸钙不动杆菌全部正确，但4株医院不动杆菌被误判为鲍曼不动杆菌，1株皮特不动杆菌被误判为医院不动杆菌，4株基因种“近13TU”全部误判为鲍曼不动杆菌，2株基因种“1与3之间”分别误判为皮特不动杆菌和醋酸钙不动杆菌。完整细胞的总体正确鉴定率为90%，细胞提取物为87%。数据库中无基因种“近13TU”和“1与3之间”的参考谱图，这两类菌株必然被错误归入数据库已有物种。

光谱特征分析表明，完整细胞质谱中约89%的峰集中在10,000 m/z以下区域，物种内变异不超过5%，且各物种呈现一致的物种特异峰型。细胞提取物质谱的峰数量超过完整细胞，主要集中在10,000 m/z以上区域，但物种内变异较高（约5–10%）。在3,000至10,000 m/z区间，所有物种共有4662、5176、6949、7435和9323 m/z等峰，可能为不动杆菌属特征峰；同时各物种至少含有一个特异性峰，如鲍曼不动杆菌5749 m/z、医院不动杆菌8139 m/z、皮特不动杆菌5779 m/z、醋酸钙不动杆菌5833 m/z、基因种“近13TU”9542 m/z、基因种“1与3之间”3908 m/z。然而，不同研究中报道的物种特异峰存在分歧，且部分峰（如2873 m/z）在本研究中同时出现在多个物种中，表明基于少数m/z峰的物种鉴定方法容易导致高误判率。

化学计量学分析中，完整细胞的PLSDA模型采用4个潜变量，解释了70.4%的光谱变异。树状图显示六个定义清晰的聚类，每个聚类仅包含单一物种的菌株，且与rpoB鉴定结果完全吻合。留一法交叉验证显示，醋酸钙不动杆菌的灵敏度为89%，其余五个物种均为100%；医院不动杆菌的特异度为95%，其余物种均为100%。细胞提取物的PLSDA模型采用8个潜变量，解释80.4%的光谱变异，但仅基因种“1与3之间”、基因种“近13TU”和皮特不动杆菌形成三个清晰的独立聚类，醋酸钙不动杆菌、鲍曼不动杆菌和医院不动杆菌之间存在一定重叠，无法完全区分。

研究结论与价值

本研究成功建立了MALDI-TOF MS结合化学计量学工具的方法，能够准确区分ACB复合群的全部六个物种。使用完整细胞质谱进行PLSDA分析可获得100%的正确物种鉴定率，与rpoB基因测序结果完全一致。该方法还首次实现了对MALDI Biotyper数据库中未包含的两个基因种（“近13TU”和“1与3之间”）的准确区分，这是直接数据库比对无法实现的。完整细胞法不仅鉴定准确率高于细胞提取物法，而且样品制备时间更短、分析成本更低。本研究证明了仅依靠数据库扩充或改变基质组成等替代方案无法从根本上解决MALDI-TOF MS在近缘物种鉴定中的局限性，而针对特定菌属优化的化学计量学模型为具有高度相似蛋白指纹的物种鉴定提供了一种有效替代途径。该方法快速、可靠且成本低廉，对临床实验室细菌鉴定的实践具有重要的应用价值。

研究亮点

本研究的突出贡献在于：（1）首次将PLSDA等化学计量学方法与MALDI-TOF MS谱图分析系统结合，用于ACB复合群全部六个物种的同时区分；（2）首次实现了对MALDI Biotyper数据库未覆盖的两个新基因种的质谱鉴定；（3）明确证实完整细胞法制备优于细胞提取物法，在简化操作的同时提高了鉴定准确率；（4）所纳入的83株菌株经多种独立分类学方法验证，涵盖了ACB复合群已知的最大表型多样性，保证了模型的外部普适性。该研究为MALDI-TOF MS在临床微生物学中突破近缘物种鉴定瓶颈提供了方法学范式，具有转化应用的潜力。