该研究由西湖大学（Westlake University）的 Mengying Chen、Gaoxingyu Huang、Qiang Su、Yigong Shi 等，美国圣约翰大学（St. John’s University）的 Zhifei Wang、Yong Yu 等，以及郑州大学第一附属医院的 Yan Shi、Zhangsuo Liu 等学者合作完成。通讯作者为 Qiang Su、Yong Yu 和 Yigong Shi。论文于2026年发表在 Nature Communications 上，标题为《Structural basis of lipid-dependent allosteric gating mechanisms for PC1-PC2 ion channel》。
常染色体显性多囊肾病（autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD）是一种常见的遗传性疾病，约每1000人中就有1人受累，表现为肾脏内多发囊肿进行性增大，最终导致肾功能衰竭。ADPKD 的致病基因分别为 pkd1 和 *pkd2*，其编码产物为多囊蛋白-1（polycystin-1, PC1）和多囊蛋白-2（polycystin-2, PC2）。PC1 是一个含有11次跨膜螺旋的大型膜蛋白，PC2 属于瞬时受体电位（TRP）通道家族，含有6次跨膜螺旋，也被称作 TRPP2。二者在初级纤毛（primary cilium）上形成1:3的异源四聚体阳离子通道复合物，参与钙信号转导、细胞增殖与分化调节以及机械刺激感知等多种关键生理过程。
初级纤毛具有独特的脂质微环境，富含氧化固醇 7β,27-二羟基胆固醇（7β,27-dihydroxycholesterol, 7β,27-DHC）和磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI4P）等特殊脂质。已有研究表明，7β,27-DHC 能够在体外增强野生型 PC1-PC2 通道的活性，而 PI4P 则可破坏这种增强效应，提示特定脂质在 PC1-PC2 通道功能调控中发挥着关键作用。然而，PC1-PC2 通道的门控机制一直未被阐明。研究团队此前报道了该通道处于关闭状态的冷冻电镜结构，但由于分辨率有限和缺乏稳定的激活配体，难以捕获开放态构象。
为了深入探究 PC1-PC2 通道的门控与激活机制，本研究系统性地解析了野生型和功能获得型突变体（gain-of-function, GOF）通道在不同条件下的多种构象，旨在揭示脂质分子如何通过变构调节来控制通道的开放与关闭，并建立其动态门控模型。
整个研究流程可分为蛋白质表达优化、冷冻电镜样品制备与数据收集、结构解析与模型搭建、功能验证以及脂质结合分析五大环节。
出于提高 PC1-PC2 复合物表达量低下的瓶颈问题，团队对表达系统进行了系统性优化。他们以人源 PC1 的 C 末端片段（CTF，残基3052–4303）和全长人源 PC2（残基1–968）为表达对象，在 PC1-CTF 的 N 端融合了一段合成信号肽和 FLAG 标签以促进膜运输和成熟。具体优化措施包括：将线性聚乙烯亚胺（PEIs）从25 kDa升级为40 kDa以提高转染效率；转染24小时后添加 SMS293-SUPI 补料以增效；将宿主细胞由 HEK293F 替换为 Expi293F；最关键的是自主设计了一种全新的表达载体 psq。该载体基于 pcAG 改造，采用 CAM 启动子增强转录，引入合成5’-UTR 提升翻译效率，整合土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）减少通读转录，并加入 TAR/Tat 系统强化转录。经过这一系列改造，PC1-PC2 复合物的最终产量从每升细胞培养物约5微克大幅提升至约500微克。
蛋白纯化流程严格按照已建立的方法进行。细胞裂解后，使用 DDM、大豆脂质和 CHS 进行膜蛋白增溶，依次通过抗 FLAG M2 亲和树脂和 Strep-Tactin 树脂进行亲和纯化，最后采用尺寸排阻色谱（SEC）进一步精纯。对于 7β,27-DHC 结合的复合物，则在 SEC 步骤前加入200微摩尔的配体进行共孵育。最终将复合物浓缩至约5毫克/毫升用于冷冻电镜制样。
纯化后的蛋白被施加到孔碳膜载网上，经 Vitrobot 快速冷冻制样，使用 Titan Krios 电子显微镜配合 K3 探测器和能量过滤器进行数据采集。数据处理方面，团队采用了 RELION 3.1 和 cryoSPARC 相结合的流程。
针对野生型（WT）复合物，从4756张显微照片中挑取约281万颗粒，经过多轮二维分类、全局和局部三维分类以及掩膜分类，最终解析出三种不同构象：WT-class I（2.3 Å）、WT-class II（2.8 Å）和WT-class III（3.2 Å），分别占总颗粒的38%、35%和27%。对于 L677A/N681A 双突变的组成型激活 aa-channel，从4275张照片中挑取约217万颗粒，通过类似的分类策略分离出 aa-class I 至 aa-class IV 四种构象，分辨率分别为3.3 Å、3.7 Å、3.4 Å和3.5 Å。对于添加 7β,27-DHC 的 WT 样品，从14,708张照片中挑取868万颗粒，经三维分类得到与 WT-class I/II 近乎相同的两种构象（3.1 Å），以及一种全新的 WT-class IV 构象（3.4 Å）。在数据处理过程中，团队灵活运用了“跳过对齐”（skip alignment）的三维分类策略，将掩膜聚焦于孔道中心区域，从而有效区分出局域构象差异。
以先前解析的 PC1-PC2 复合物结构（PDB: 6A70）为初始模型，使用 UCSF ChimeraX 进行刚体拟合，并通过 Coot 手动调整和 PHENIX 实空间精修，同时采用两个半图（half-map）交叉验证以防止过拟合。在高质量电镜密度图的支持下，此前未能搭建的 PC1 孔道环（pore loop）在 WT-class I 和 II 中得以完整构建，并首次识别出嵌入孔道中心的磷脂分子密度。
为验证结构发现，团队开展了多种电生理和生化实验。
爪蟾卵母细胞电生理：将野生型和各类突变体的 PC1-CTF 与 PC2 RNA 共同注射入去除滤泡膜的爪蟾卵母细胞，培养3–6天后使用双电极电压钳（TEVC）记录全卵母细胞电流。通过比较突变体与野生型及未注射组的电流幅值，评估孔道残基的功能。在离子渗透性分析中，替换外液中的 Na⁺ 为 Li⁺、胍离子、Tris、二甲胺（DMA）和 NMDG⁺ 等，并根据 Goldman-Hodgkin-Katz 方程计算相对渗透率比值。
HEK293 细胞膜片钳：使用四环素诱导稳定表达 PC1 和 PC2 的 HEK293 细胞系，采用全细胞膜片钳技术检测 7β,27-DHC 对通道电流的影响。尽管成功率较低，但部分细胞记录到了与先前报道一致的电流增强。
质谱鉴定：利用串联质谱（LC-MS/MS）技术定量分析纯化的 PC1-PC2 复合物中 7β,27-DHC 的结合量。蛋白经胰蛋白酶消化后，使用甲基叔丁基醚萃取脂质，通过 Agilent 6545 Q/TOF 和 SCIEX QTRAP 6500+ 质谱仪在正离子模式下采用多反应监测（MRM）扫描，以标准品为参照对不同样品中的 7β,27-DHC 相对含量进行精确定量。
在 WT-class I 和 II 的高分辨率结构中，研究团队在通道中央孔道区域发现了磷脂样密度，并分别将其指认为磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol, PG）和磷脂酸（phosphatidic acid, PA）。这两种带负电的磷脂分子横向插入孔道空腔内，其亲水头部深埋于孔道中心，疏水尾部指向外侧。PG 的磷酸基团和甘油羟基与 PC1 的 Arg4094 及 PC2 的 Ile640 形成氢键，而 PA 则主要通过 Asn674 锚定。这种结合将离子渗透通路物理性堵塞，使通道锁定于失活状态，恰似一把“门闩”（latch）。
在 WT-class III 构象中，孔道内的脂质密度完全消失，表明 PG 或 PA 已发生解离。与此同时，第三个 PC2 亚基（PC2III）的 TOP 结构域（TOPIII）和电压感受器样结构域（VSDIII）相对于 WT-class I/II 发生了约30°的旋转，PC1 的孔道环也变得无序。尽管磷脂这道“门闩”已经打开，孔道半径分析却表明该构象在四个收缩位点处仍然过于狭窄，最窄处半径小于脱水钠离子的0.95 Å，因此 WT-class III 并非导电状态，而是一个“预开放”构象。这一构象转变说明磷脂解离与 TOPIII/VSDIII 的构象运动是耦合的。
在组成型激活的 aa-channel（L677A/N681A）中，四种构象的 TOPIII 分别旋转约0°、15°、60°和120°，表现出逐步远离 TOPII 的趋势。与野生型不同，aa-channel 的所有构象的孔道内均无磷脂密度，因为 Leu4099 和 Phe676 的侧链封锁了脂质结合腔。随着 TOPIII/VSDIII 旋转角度的增大，孔道半径逐渐扩张。在 aa-class IV 中，最窄收缩位点的半径达到约1.7 Å，足以允许部分水合阳离子通过，表明该构象为真正的开放状态。针对收缩位点2的突变（如 N674A、R4100A）能显著改变离子渗透性，进一步证实该位点在调控离子传导中的关键作用。
在 7β,27-DHC 存在下解析出的 WT-class IV 构象中，研究者发现该配体嵌于由 S1III/S4III、S5PC1/S6bPC1、S5III/S6III 以及 S4-S5III 连接区等围成的疏水空腔中。7β,27-DHC 通过与 Leu4031、Phe579 等非极性残基的范德华力以及 Glu4025、Lys688 等形成的极性相互作用而稳定结合。质谱分析表明，WT 通道结合的 7β,27-DHC 量是对照的5倍，而突变体 G4028W 和 E4025R 的结合量则显著降低，证实了结构中的结合位点。
7β,27-DHC 的结合扮演着“楔子”（wedge）的角色：它插入后导致 S5PC1 与 S4-S5III 的相互作用被破坏，S4-S5III 发生约4 Å的侧向平移，进而拉动 S6III 向旋转轴心移动约2 Å。这一系列变构传递使得 TOPIII/VSDIII 相对于 WT-class III 进一步旋转约120°，孔道收缩位点4的半径由约0.6 Å扩大至约2 Å。然而，收缩位点2的半径仍小于脱水钠离子半径，表明 WT-class IV 依旧处于非导电状态。这一发现解释了为何在 HEK293 细胞中单独施加 7β,27-DHC 仅能以极低的成功率激活通道——7β,27-DHC 虽能促使通道趋于开放，但可能仍需额外的辅因子或特定的细胞环境才能实现完整的孔道开放和离子传导。
本研究通过解析野生型、功能获得型突变体以及配体结合状态下 PC1-PC2 通道的十种不同构象，系统性地提出了一个“门闩与楔子”（latch and wedge）模型，用以阐述该通道的脂质依赖性变构门控机制。在内质网或细胞质膜上，PG 或 PA 作为“门闩”插入孔道，将通道锁定于失活态；当“门闩”解除后，TOPIII/VSDIII 构象发生旋转，通道进入预开放态。在富含 7β,27-DHC 的纤毛膜环境中，该氧化固醇作为“楔子”插入特定空腔，进一步驱动 TOPIII/VSDIII 旋转并扩大孔道，尽管完全开放可能还需要