研究团队与发表信息
本研究由Yu Yan、Dingran Chang、Yongbin Xu等学者共同完成，通讯作者为Yingfu Li（加拿大麦克马斯特大学）和Meng Liu（大连理工大学）。成果发表于《Journal of the American Chemical Society》（JACS）2023年1月19日刊，标题为《Engineering a Ligase-Binding DNA Aptamer into a Templating DNA Scaffold to Guide the Selective Synthesis of Circular DNazymes and DNA Aptamers》。

学术背景与目标
研究聚焦于功能性核酸（Functional Nucleic Acids, FNAs），如脱氧核酶（DNazymes）和DNA适体（aptamers）的环化合成。环状FNAs因具有抗核酸酶降解、热力学稳定性高及兼容滚环扩增（Rolling Circle Amplification, RCA）等特性，在生物传感和医学诊断中潜力巨大。然而，传统方法（如T4 DNA连接酶或Circligase介导的环化）存在产率低、易产生线性聚合副产物等问题。本研究旨在开发一种通用型DNA模板支架（Templating DNA Scaffold, TDS1），通过定向引导T4 DNA连接酶（T4DL）实现高效、高选择性的单链DNA（ssDNA）分子内环化。

研究流程与方法
1. 体外筛选（SELEX）获得可连接DNA适体
- 对象：随机序列DNA库（DL1），包含40个随机核苷酸（N40）及恒定序列。
- 步骤：
- 环化反应：DL1与T4DL孵育，筛选出可被T4DL环化的DNA适体（CTA）。
- 滚环扩增（RCA）：使用Phi29 DNA聚合酶扩增CTA，生成串联重复序列。
- 限制性酶切：用EcoRV消化扩增产物，生成单体（RP1）。
- 迭代筛选：共进行14轮SELEX，最终富集到主导序列DAS1（占比24%）。
- 创新点：结合多酶反应（连接酶、聚合酶、限制酶）的迭代筛选策略。

1. DAS1的结构与功能表征

   • 二级结构：通过mFold预测，DAS1含单链区（ss1）、双链区（p1-p3）及发夹环（l1-l3）。
     
   • 性能测试：
     
     • 环化效率（Y%）：DAS1在10分钟内环化率达90%，选择性（S%）达97%。
       
     • 结合亲和力：荧光各向异性实验显示DAS1与T4DL的解离常数（Kd）为300 nM，显著优于突变体（DAS1m）。
       
   • 突变分析：对61个DAS1突变体测试，鉴定出ss1和j2/3区域的关键核苷酸。
     

2. 构建模板支架TDS1及应用验证

   • 设计：保留DAS1的ss1、j2/3等关键区域，改造p1-l1和p3-l3以适配外源DNA。
     
   • 应用案例：
     
     • 环状脱氧核酶（cEC1）：用于大肠杆菌检测，环化产率94%，检测限（LOD）达10³细胞/毫升，较线性EC1灵敏度提升10倍。
       
     • 环状DNA适体：针对艰难梭菌毒素B的传感器，LOD为0.1 nM，临床样本检测时间仅2.5小时。
       
   • 通用性验证：TDS1成功环化不同长度随机DNA库（10-80 nt），环化选择性均>94%。
     

主要结果与逻辑关联
- DAS1的高效环化：其结构特性（如ss1-j2/3弱相互作用）是选择性分子内环化的关键，为TDS1设计奠定基础。
- TDS1的普适性：通过调整支架结构，可适配多种功能核酸（如DNazymes、aptamers），解决传统方法副反应多的问题。
- 生物传感性能：环状cEC1在尿液样本中稳定性显著优于线性版本，验证了环化策略的临床应用潜力。

结论与价值
1. 科学价值：首次将DNA适体工程化为模板支架，实现了ssDNA的高效定向环化，为环状FNAs的合成提供了通用策略。
2. 应用价值：
- 诊断技术：开发的环状传感器在细菌检测和毒素识别中展现高灵敏度与特异性。
- 工具开发：TDS1可推广至其他功能核酸的环化，助力核酸纳米技术、分子计算等领域。

研究亮点
1. 方法创新：将SELEX筛选与结构工程结合，开发出兼具连接酶结合与模板功能的DNA支架。
2. 性能突破：环化选择性和产率（>90%）远超传统方法（如DNA splint策略的Y%<60%）。
3. 跨学科应用：成果覆盖化学生物学、诊断医学及DNA纳米技术，体现了“设计-验证-应用”的全链条研究。

其他价值
- 为环状核酸库的构建提供新方法，支持后续SELEX筛选高稳定性核酸探针。
- 提出的“弱相互作用引导环化”机制可拓展至其他酶-底物系统的定向改造。