该文档属于类型a，是一篇关于寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）NS5甲基转移酶（methyltransferase, MTase）抑制剂发现与机制研究的原创研究论文。该研究由中国医学科学院北京协和医学院药物研究所的宋维宝（Weibao Song）、张宏娟（Hongjuan Zhang）等研究人员完成，通讯作者为林媛（Yuan Lin）、韩燕星（Yanxing Han）和蒋建东（Jiandong Jiang）。论文发表于 Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 期刊，2021年4月7日正式刊出，文章DOI为10.3389/fcimb.2021.665379。
寨卡病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）中的蚊媒黄病毒属，与登革病毒（DENV）、黄热病毒（YFV）、西尼罗病毒（WNV）、日本脑炎病毒（JEV）等病原体同属一类。2013年法属波利尼西亚暴发寨卡疫情之前，该病毒感染通常被认为只引起轻微疾病。然而，2015年寨卡病毒在美洲大规模传播，并导致严重的吉兰-巴雷综合征（Guillain-Barré syndrome）等神经系统并发症，因此世界卫生组织宣布其为全球公共卫生紧急事件。至今尚无有效的疫苗或药物用于预防或治疗寨卡病毒感染。寨卡病毒NS5蛋白是病毒编码的最大的非结构蛋白，其N端为甲基转移酶结构域，C端为RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）结构域。NS5 MTase以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine, SAM）为甲基供体，负责病毒RNA帽子结构的N-7-甲基鸟苷和2′-O-甲基腺苷的甲基化，这两种甲基化活性均对病毒复制至关重要。因此，抑制MTase活性被认为是一种极具前景的抗寨卡病毒策略。本研究旨在建立寨卡病毒NS5 MTase抑制剂筛选模型，并发现和表征具有抗寨卡病毒活性的先导化合物。
研究流程方面，该研究首先构建了寨卡病毒NS5 MTase重组蛋白表达质粒并进行了蛋白表达与纯化。将NS5 MTase的cDNA片段（第7666至8463位核苷酸，ZIKASPH2015株，GenBank编号KU321639.1）克隆至pET-30a(+)表达载体，转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达，并通过Ni²⁺亲和层析柱纯化获得野生型（WT）MTase蛋白，分子量约为35 kDa。随后，研究建立了基于发光的甲基转移酶活性检测方法，其原理为通过MTase-Glo试剂将MTase反应生成的副产物S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl-homocysteine, SAH）依次转化为ADP和ATP，最终通过发光信号检测酶活性。时间进程实验显示WT-MTase的酶活性在0至60分钟内随时间增加而增强，反应35分钟后趋于稳定。之后，研究利用建立的筛选模型对包含228个化合物的天然产物库进行筛选。初筛浓度为20 μM，筛选出茶黄素（theaflavin）和壳聚糖（chitosan）两种MTase抑制活性超过50%的化合物。进一步测定IC₅₀时发现茶黄素的IC₅₀为10.10 μM，优于壳聚糖的26.99 μM，因此选择茶黄素进行后续研究。以广谱MTase抑制剂sinefungin为阳性对照，其IC₅₀为4.03 μM，筛选模型的Z′因子为0.86，说明该筛选体系具有良好的可靠性。
为阐明茶黄素与MTase的结合机制，研究采用分子对接方法，使用Discovery Studio 2018 R2软件中的CDOCKER协议，以寨卡病毒MTase晶体结构（PDB ID: 5WXB）为受体进行对接分析。结果显示茶黄素通过两个经典氢键与MTase结合，其中一个氢键由茶黄素的羟基与D146残基形成，D146是位于SAM结合位点的关键氨基酸；另一个氢键则由茶黄素的氧原子与K182残基形成。据此推测茶黄素对MTase活性的抑制作用主要依赖于其与D146之间的氢键相互作用。为验证该机制，研究进行了定点突变实验，构建了D146A-MTase和K105A-MTase两种突变体蛋白。酶活性分析显示K105A-MTase活性较WT-MTase仅轻微下降，而D146A-MTase活性则急剧降低。在抑制实验中，茶黄素对D146A-MTase的IC₅₀为198.70 μM，对K105A-MTase的IC₅₀为37.76 μM，而对WT-MTase的IC₅₀为10.10 μM。与WT相比，D146A突变使茶黄素的IC₅₀升高约20倍，而K105A突变仅使IC₅₀略有上升。这一结果结合分子对接分析表明，茶黄素通过与D146结合来抑制NS5 MTase活性。
为直接验证茶黄素与MTase之间的相互作用，研究采用了表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）技术。实验分别将WT-MTase和D146A-MTase包被在CM5传感芯片上，然后注入不同浓度（0–200 μM）的茶黄素溶液。结果显示茶黄素与WT-MTase的结合呈剂量依赖性增强，而D146A-MTase与茶黄素的结合信号明显降低。SPR分析得到茶黄素与WT-MTase的平衡解离常数（K_D）为6.44×10⁻⁵ M，而与D146A-MTase的K_D升至25.19×10⁻⁵ M，约为前者的4倍，表明D146突变显著减弱了茶黄素与MTase的结合强度，进一步证实D146是茶黄素发挥抑制作用的关键位点。
在抗病毒活性评价方面，研究采用基于寨卡病毒诱导的细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）的细胞活力检测方法。以氯喹（chloroquine）为阳性对照，在Huh-7细胞中评估茶黄素的抗寨卡病毒活性。结果显示茶黄素和氯喹均能剂量依赖性地恢复细胞活力或保护细胞免受CPE损伤，茶黄素的半数有效浓度（EC₅₀）为8.19 μM，氯喹的EC₅₀为2.55 μM。此外，通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测培养上清中的病毒RNA拷贝数，发现20 μM茶黄素处理可减少超过50%的病毒RNA，且抗病毒活性亦呈剂量依赖性。细胞毒性实验采用CCK-8法，结果显示茶黄素对Huh-7细胞的半数细胞毒性浓度（CC₅₀）高于128 μM，是其EC₅₀的10倍以上，表明茶黄素的抗寨卡病毒作用并非源于细胞毒性。
本研究的结论为：茶黄素是一种能够直接与寨卡病毒NS5 MTase的SAM结合位点关键氨基酸D146结合的天然多酚类化合物，通过抑制MTase活性从而发挥抗寨卡病毒复制作用。茶黄素是首个被报道可直接结合寨卡病毒NS5 MTase活性位点D146的天然化合物。与已知的MTase抑制剂sinefungin相比，茶黄素具有更好的细胞水平抗寨卡病毒活性；与广谱黄病毒MTase抑制剂NSC 12155相比，茶黄素表现出更明确的结合机制和较低的细胞毒性。因此，茶黄素有望通过基于结构的优化和合理设计，发展成为有效的抗寨卡病毒候选药物。同时，由于MTase也是SARS-CoV-2的重要药物靶点，本研究的结果也为COVID-19药物发现提供了一定的参考价值。
研究的亮点在于：第一，建立了高效、稳定的寨卡病毒NS5 MTase抑制剂筛选模型（Z′因子为0.86），为后续大规模筛选提供了可靠平台；第二，从天然产物库中发现了茶黄素这一新型寨卡病毒NS5 MTase抑制剂，其IC₅₀为10.10 μM，EC₅₀为8.19 μM，且细胞毒性低；第三，通过分子对接、定点突变和SPR实验系统地阐明了茶黄素的作用机制，确认D146为其关键结合位点；第四，茶黄素作为一种来源于茶叶的天然多酚化合物，具有多种已知生物活性，本研究发现其抗寨卡病毒的新功能，为天然产物在抗病毒药物开发中的应用提供了新的实验依据。此外，该研究还提示NS5 MTase的SAM结合位点及其邻近的保守疏水口袋可作为抗寨卡病毒药物设计的有效靶标区域。这些结果不仅为寨卡病毒药物研发提供了有前景的先导化合物，也丰富了以MTase为靶点的抗病毒策略的理论与实践基础。