关于Rett综合征疾病进展性别特异性单细胞转录组特征的研究报告
本研究的主要作者为Osman Sharifi，其所属机构为美国加州大学戴维斯分校医学院医学微生物学与免疫学系、基因组中心以及MIND研究所。合作作者包括Viktoria Haghani、Kari E. Neier、Keith J. Fraga、Ian Korf、Sophia M. Hakam、Gerald Quon、Nelson Johansen、Dag H. Yasui和Janine M. Lasalle，其中Dag H. Yasui和Janine M. Lasalle为共同通讯作者。这项研究成果以题为“Sex-specific single cell-level transcriptomic signatures of Rett syndrome disease progression”的论文形式，于2024年发表在《自然》子刊《通讯-生物学》（Communications Biology）上。
一、研究的学术背景 本研究的科学领域属于神经发育障碍的分子机制研究，具体聚焦于Rett综合征。Rett综合征是一种主要影响女性的严重神经发育障碍，由X染色体上的MECP2基因（甲基化CpG结合蛋白2基因）杂合突变引起。由于女性存在一条X染色体随机失活现象，使得患者大脑成为同时含有野生型和突变型MECP2表达细胞的嵌合体。该病的典型特征是婴儿期（6-18个月）发育看似正常后，出现发育里程碑的进行性倒退，包括语言丧失、运动异常等。尽管已知MECP2是神经元基因表达的关键调节因子，但其缺陷如何在细胞和分子水平上导致这种独特的、具有性别差异的进行性疾病表型，尤其是考虑到女性大脑的细胞嵌合性时，其机制尚不清楚。传统的Rett研究多使用雄性Mecp2敲除（null）小鼠模型，该模型虽有助于理解MECP2功能，但并非能完全模拟人类女性患者遗传构造和疾病进展相关特征的理想模型。
因此，本研究旨在利用一个构建相关（construct-relevant）的Mecp2e1突变小鼠模型（模拟人类Rett突变），通过纵向单细胞核RNA测序技术，探究在Rett综合征疾病进展过程中，细胞类型、性别以及由X染色体失活导致的细胞嵌合性对大脑皮层转录组的具体影响。研究目标是揭示疾病进展的分子动力学，特别是非细胞自主性效应的作用，并评估不同性别小鼠模型在模拟人类Rett皮层转录组失调方面的相关性。
二、研究的详细工作流程 本研究设计严谨，包含多个相互关联的步骤。
实验设计与动物模型：研究采用Mecp2e1突变小鼠模型，该模型特异性地破坏了MECP2蛋白的E1亚型，能更好地模拟人类Rett突变并再现延长的疾病症状进展过程。实验设置了四个纵向出生后时间点，对应不同的疾病阶段：症状前期、疾病起始期和疾病晚期。研究者收集了雄性和雌性突变小鼠及其同窝野生型对照的皮层样本，共计28个样本。对小鼠进行了表型评分（包括毛发、腹部、活动性等）和体重记录，以量化疾病进展。
单核RNA测序与细胞类型鉴定：从每个皮层样本中分离出细胞核，使用10x Genomics的5’单核RNA测序平台进行文库构建和高通量测序。经过质控后，共分析了93,798个高质量细胞核。利用无监督聚类和参考图谱（Allen Brain Atlas）的细胞类型标记基因，将皮层细胞核鉴定为14种不同的细胞类型，包括4种兴奋性神经元（对应皮层2-6层）、5种抑制性神经元以及5种非神经元细胞（如星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞等）。这种方法确保了高分辨率地解析细胞类型特异的转录变化。
计算实验设计：为系统探究不同因素，研究者设计了五个计算比较实验：实验1比较雄性突变体与雄性野生型所有细胞；实验2比较雌性突变体与雌性野生型所有细胞；实验3比较雌性嵌合体（Mecp2e1-/+）中表达野生型Mecp2的细胞与纯合野生型（Mecp2e1+/+）中表达野生型Mecp2的细胞，旨在探究对野生型细胞的非细胞自主性影响；实验4比较雌性嵌合体中表达突变型Mecp2的细胞与纯合野生型中表达野生型Mecp2的细胞，探究突变细胞本身的缺陷；实验5比较雌性嵌合体内部的突变型与野生型表达细胞，进一步验证微环境内的差异。
差异表达基因与通路分析：研究者评估了多种差异表达基因分析方法，最终选择了能有效控制同一动物来源细胞间相关性且对高表达基因灵敏度高的limma-voom共识相关法进行主要分析，并辅以DESingle分析低表达基因。对鉴定出的DEGs进行京都基因与基因组百科全书通路富集分析，以揭示失调的生物学通路。
共表达网络分析：为补充DEG分析，研究者采用了专门为高维数据设计的系统生物学方法——高清晰度加权基因共表达网络分析。该方法将所有细胞类型和条件下检测到的基因根据共表达模式分组为不同的模块（共9个）。计算每个模块的特征基因值，并将其与基因型、疾病评分、体重、性别、时间点等表型变量进行关联分析，以识别与疾病进展密切相关的基因网络。
细胞嵌合性与等位基因解析：为在雌性嵌合体中区分表达野生型Mecp2和突变型Mecp2的细胞，研究者开发了生物信息学流程。他们从原始测序数据中提取并比对所有Mecp2基因的读数，根据翻译起始密码子（ATG为野生型，TTG为突变型）对每个细胞的等位基因状态进行分型，从而能够在单细胞水平上解析嵌合性，并用于上述实验3-5的分析。
与人类数据的比对：为验证小鼠模型的翻译相关性，研究团队还对8例人类女性Rett患者和8例年龄匹配对照者的死后大脑皮层样本进行了snRNA-seq分析。使用类似流程鉴定了细胞类型，并进行了DEG分析。最后，系统地比较了人类Rett皮层细胞与雌性/雄性Mecp2e1突变小鼠皮层细胞的转录组失调重叠情况。
三、研究的主要结果 研究取得了一系列层次分明且相互印证的重要发现。
性别二态性的转录失调轨迹：DEG分析揭示了雄性和雌性突变小鼠皮层转录失调存在本质差异。在症状前期，雌性突变体皮层细胞就出现了1215个DEGs，而雄性仅有9个。随着疾病进展，雌性突变体的DEG数量逐渐减少，而雄性则逐渐增加。在整个疾病过程中，雌性突变体的总DEG数量是雄性的6倍多。这表明雌性模型的疾病进程在分子水平上与雄性截然不同，并非简单的严重程度较轻的版本。
动态且细胞类型特异性的通路失调：KEGG通路富集分析进一步凸显了性别差异。雌性突变体在症状前期（P30）的抑制性神经元中，就出现了14条内稳态通路的显著富集，包括突触小泡循环、逆行内源性大麻素信号、催产素信号、谷氨酸能突触、昼夜节律夹带等。这些通路的失调随后在疾病起始期转移到兴奋性神经元，在疾病晚期又转移到星形胶质细胞，呈现出一种动态的、在细胞类型间“传递”的模式。相反，雄性突变体在整个过程中仅持续富集少数通路（如胃酸分泌）。这提示雌性Rett的疾病进展涉及广泛且动态的神经内稳态网络失调。
共表达网络与疾病表型强相关：HDWGCNA分析构建的9个基因共表达模块中，有6个与所有研究的表型变量显著相关。例如，某些模块的特征基因表达与疾病评分、体重、基因型在特定细胞类型中高度相关。这些模块富含与神经系统疾病、代谢和成瘾相关的通路，印证了DEG分析的结果，并提供了与疾病进展表型直接关联的基因网络视图。
动态的非细胞自主性效应是核心特征：通过对雌性嵌合体细胞的精细解析，研究取得了突破性发现。在实验3中，即使比较的都是表达野生型Mecp2的细胞，来自嵌合体雌性的细胞与来自纯合野生型雌性的细胞相比，在症状前期也存在大量基因表达差异（2216个DEGs），这明确证明了强大的非细胞自主性效应。这种效应是动态变化的：在症状前期以基因下调为主，在疾病起始期转变为以上调为主，到疾病晚期又回到下调为主，且每个时期的失调基因和富集通路都有很大不同。相比之下，实验5（嵌合体内部突变型vs野生型细胞）检测到的差异非常小。这些结果强烈表明，在雌性Rett模型中，转录失调主要由野生型细胞对突变细胞微环境的动态响应（即非细胞自主性效应）所驱动，而非突变细胞自身缺陷的直接扩增。野生型细胞试图维持内稳态，但其代偿努力随着疾病进展而发生动态变化。
雌性嵌合小鼠模型更好地模拟人类Rett转录组：与人类女性Rett皮层转录组数据的比对显示，雌性Mecp2e1-/+小鼠的DEGs与人类Rett的DEGs存在大量显著重叠。无论是上调还是下调的基因，同源基因在小鼠模型中都显示出相同的表达变化趋势。相反，雄性Mecp2e1-/y小鼠的转录组变化与人类Rett的重叠极少。这证明，包含细胞嵌合性的雌性突变小鼠，在转录组水平上比传统的雄性敲除模型能更准确地模拟人类Rett疾病。
四、研究的结论与意义 本研究的结论是：Rett综合征在雌性个体中的疾病进展，是由细胞类型特异性、性别依赖且随时间动态变化的转录组失调所定义的，其中非细胞自主性效应扮演了核心角色。表达野生型MECP2的细胞对突变微环境作出的动态响应，主导了内稳态基因通路的广泛失调，并与进行性的疾病表型相关。包含细胞嵌合性的雌性Mecp2e1突变小鼠是模拟人类Rett转录组特征和相关疾病机制的更优临床前模型。
该研究的科学价值重大：它首次在构建相关且性别匹配的Rett小鼠模型中，系统揭示了疾病进展的全周期单细胞转录组图谱，明确了性别和细胞嵌合性的关键影响。研究将非细胞自主性效应提升为理解Rett病理机制的核心概念，为解释为何症状在婴儿期后才出现并呈阶段性进展提供了分子依据。应用价值在于：首先，它强调未来针对Rett的临床前治疗研究应优先使用雌性且构建相关的动物模型。其次，症状前期即出现显著转录失调的发现，支持将MECP2突变筛查纳入新生儿筛查，以实现早期干预。最后，研究揭示的失调通路与神经退行性疾病、代谢和成瘾通路重叠，提示现有针对这些通路的药物或有被重新用于治疗Rett某些症状成分的潜力。
五、研究的亮点 1. 模型创新性：坚持使用模拟人类突变的Mecp2e1雌性嵌合体小鼠作为核心模型，而非传统的雄性敲除模型，使研究结论更具临床翻译相关性。 2. 研究设计系统性：结合了纵向时间点、多细胞类型解析、性别对比、嵌合体内部等位基因分型以及人类数据验证，构成了一个极其全面和严谨的研究体系。 3. 方法学严谨性：综合评估并应用了多种生物信息学方法进行DEG鉴定，并引入了HDWGCNA系统生物学分析，从不同角度验证和丰富了发现。 4. 核心发现突破性：清晰揭示了雌性Rett转录失调在症状前期即已发生、且动态变化的特点；以坚实的数据证明了非细胞自主性效应在疾病进展中的主导和动态角色，是领域内的重要概念推进。 5. 技术开发应用：开发了从snRNA-seq数据中解析特定基因（如Mecp2）等位基因状态的生物信息学流程，为研究其他X连锁疾病或嵌合现象提供了有用工具。
六、其他有价值的内容 研究还发现，在症状前期的雌性突变体抑制性神经元中，DEGs显著富集了包括Xist、Meg3等在内的印记基因，这一现象在雄性中未观察到，暗示X染色体失活和基因组印记之间可能存在与Rett相关的交互作用，这是一个值得未来深入探讨的方向。此外，研究未能在该模型中发现此前报道的MECP2缺陷导致长基因普遍抑制的现象，提示不同模型或分析方法可能带来差异，也体现了本研究所用方法和模型的特殊性。