关于新型双相真菌Emergomyces africanus体外抗真菌药物敏感性研究学术报告

一、 主要作者、机构及发表信息

本研究由来自南非和多个国际机构的科研人员共同完成。主要作者包括 Tsidiso G. Maphanga（第一作者，来自南非国家传染病研究所及自由州大学健康科学学院）、Erika Britz、Thokozile G. Zulu、Ruth S. Mpembe、Serisha D. Naicker、Ilan S. Schwartz（来自安特卫普大学和曼尼托巴大学）以及 Nelesh P. Govender（通讯作者，来自南非国家传染病研究所、威特沃特斯兰德大学和开普敦大学）。该研究于2017年6月发表在《Journal of Clinical Microbiology》期刊第55卷第6期，标题为“In vitro antifungal susceptibility of yeast and mold phases of isolates of dimorphic fungal pathogen Emergomyces africanus (formerly Emmonsia sp.) from HIV-infected South African patients”。

二、 学术背景与研究目的

本研究属于医学真菌学和临床微生物学领域，聚焦于一种新近被描述和重命名的双相性真菌病原体——非洲Emergomyces菌（Emergomyces africanus，曾归类于Emmonsia属）。该病原体是引起南非艾滋病患者中播散性Emergomyces病（原称播散性Emmonsiosis）的重要病因。播散性Emergomyces病是一种多系统疾病，病死率高，临床表现（如发热、广泛皮肤病变、肺炎）常导致误诊。

在开展本研究时，尚无针对该病的临床治疗试验，治疗建议主要基于对其他双相真菌（如组织胞浆菌）的治疗指南以及有限的回顾性临床观察。回顾性数据提示，使用两性霉素B序贯三唑类药物的患者预后可能优于单用三唑类药物，但证据强度有限。特别是，在南非公共卫生体系中，氟康唑因价格低廉、易于获取而被广泛使用，但其疗效是否与其他三唑类药物（如伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑）相当，尚不清楚。此外，对于此类双相真菌，缺乏标准化的体外药物敏感性测试方法，且针对其酵母相和霉菌相的全面药敏数据几乎空白。

因此，本研究旨在：1) 比较并确定E. africanus酵母相和霉菌相对多种抗真菌药物的体外敏感性；2) 评估不同测试方法（参考肉汤微量稀释法和商业Etest法）的结果一致性；3) 初步探索体外最低抑菌浓度（MIC）与患者临床结局之间的关联，从而为临床管理播散性Emergomyces病提供关键的实验室数据支持。

三、 详细研究流程

本研究是一项实验室与临床数据相结合的回顾性研究，主要包括以下步骤：

1. 病例定义与菌株收集：研究团队通过南非国家传染病研究所的被动实验室监测网络，收集了2008年至2016年间从南非九家公立及私立诊断实验室分离的E. africanus菌株。播散性Emergomyces病的定义为：从任何正常无菌部位培养出真菌，并经表型和分子方法确认为E. africanus。最终，研究纳入了51例播散性Emergomyces病病例的菌株。

2. 菌株鉴定：对50株保存的E. africanus菌株进行了重新鉴定。首先通过表型特征确认：在沙氏琼脂上于25°C和30°C培养霉菌相，观察其典型的微观形态（分隔菌丝、与菌丝成直角的细长分生孢子梗、每个分生孢子梗上着生2-3个圆形分生孢子）。随后，将霉菌相菌块接种于脑心浸液（BHI）-5%绵羊血琼脂斜面或BHI琼脂平板，在35°C下培养1-2周，诱导其转化为酵母相，并通过革兰染色观察典型的卵圆形、出芽酵母细胞形态。最后，使用酵母相菌株提取基因组DNA，通过PCR扩增并测序核糖体基因的内部转录间隔区（ITS）区域，利用NCBI BLAST数据库进行比对，从分子水平确认菌株为E. africanus。质控菌株为白色念珠菌ATCC 90028。

3. 体外抗真菌药物敏感性测试：对50株E. africanus的酵母相和霉菌相均进行了药敏测试。

   • 测试方法：采用了参考方法（肉汤微量稀释法，BMD）和商业方法（Etest法）。BMD法基本遵循美国临床和实验室标准协会（CLSI）的M27-A3（酵母相）和M38-A2（霉菌相）指南，但对霉菌相的接种物浓度进行了调整（使用2麦氏浊度标准，以获得约2.5 x 10^5 CFU/ml的终浓度），并将所有培养板的孵育和判读时间延长至7天，以促进生长和终点判读。Etest法则按照制造商说明，使用含2%葡萄糖的RPMI 1640培养基平板进行。
   • 测试药物与判读：
     • BMD法测试了伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、氟康唑、氟胞嘧啶、阿尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净。酵母相MIC终点判读为50%生长抑制；霉菌相中，氟康唑和氟胞嘧啶判读50%抑制，伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑和两性霉素B判读100%抑制。对于霉菌相，棘白菌素类药物判读最低有效浓度（MEC），即出现微小颗粒状菌落（微菌落）的最低浓度。
     • Etest法测试了两性霉素B、伏立康唑、伊曲康唑和泊沙康唑的MIC。伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑判读80%抑制（忽略椭圆抑菌圈内的微菌落），两性霉素B判读100%抑制。
   • 质控措施：每批次测试均包含质控菌株：酵母相为近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258；霉菌相为烟曲霉NCPF 7097和NCPF 7100。同时，研究还使用了E. africanus NCPF 4164作为附加质控。通过菌落计数验证接种物的纯度和准确性。

4. 临床数据收集与分析：通过查阅患者病历，收集了人口统计学特征、HIV状况、CD4+ T淋巴细胞计数、抗逆转录病毒治疗史、诊断时临床表现、抗真菌治疗方案以及临床结局（生存/死亡）等信息。最终，37例（73%）患者的临床结局和34例（67%）患者的治疗信息可供分析。

5. 数据分析方法：计算了每种抗真菌药物和测试方法的几何平均MIC（GM MIC）、MIC50和MIC90。使用Wilcoxon秩和检验比较酵母相和霉菌相之间以及BMD法和Etest法之间的MIC值差异。采用多变量逻辑回归模型，评估年龄、性别、省份、CD4细胞计数、抗逆转录病毒治疗史、抗真菌治疗、标本类型以及关键抗真菌药物的MIC50等因素与患者死亡结局之间的关联。统计分析使用Stata 14.0软件进行，P值≤0.05认为有统计学意义。

四、 主要研究结果

1. 病例与菌株特征：在可获得数据的45例E. africanus感染患者中，100%为HIV感染者，中位CD4细胞计数极低，仅为12 cells/μl。菌株主要分离自皮肤活检标本（23株）、血液（18株）和骨髓（6株）。

2. 体外抗真菌药物敏感性结果：

   • 高效药物：伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑和两性霉素B对E. africanus的酵母相和霉菌相均表现出最强的体外活性。BMD法和Etest法测得的伊曲康唑GM MIC均为0.01 mg/L。伏立康唑和泊沙康唑的BMD法GM MIC均为0.01 mg/L，而Etest法GM MIC更低（伏立康唑0.001 mg/L，泊沙康唑0.002 mg/L）。两性霉素B的Etest法GM MIC，酵母相为0.03 mg/L，霉菌相为0.01 mg/L。
   • 次优药物：氟康唑的活性相对较弱，其BMD法GM MIC为0.18 mg/L（酵母相和霉菌相）。研究明确指出，氟康唑的效力低于其他三唑类药物。
   • 无效药物：棘白菌素类（卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净）和氟胞嘧啶的MIC50、MIC90和GM MIC值均很高，表明其在体外对E. africanus活性非常有限，提示这些药物在临床治疗中可能没有价值。
   • 相别与方法学比较：酵母相和霉菌相对所有测试药物的GM MIC均无统计学显著差异。BMD法和Etest法对伊曲康唑的GM MIC结果一致，但BMD法对伏立康唑和泊沙康唑测得的GM MIC显著高于Etest法。作者推测，这可能是因为大多数菌株对这些药物的MIC值处于或低于测试范围下限，两种方法测试的药物浓度范围不同可能造成了这种差异。基于此，研究认为两种方法均可用于E. africanus的药敏测试。

3. MIC分布与患者结局的关联：37例已知结局患者的总体病死率为38%（14/37）。多变量逻辑回归模型分析显示，只有从血液（与皮肤活检标本相比，比值比[OR]为8.6）或骨髓（OR为12.1）中分离出菌株与患者死亡风险显著增加相关。而所测试的各种抗真菌药物的MIC值（MIC50）与患者结局之间没有显示出统计学上的显著关联。作者对此结果提出了两种解释：第一，血培养或骨髓培养阳性可能反映了患者体内更高的真菌负荷；第二，仅从血液或骨髓而非皮肤组织分离出病原体，可能意味着临床医生早期未能考虑到深部真菌感染的可能性，从而延误了诊断和治疗。

五、 研究结论与意义

本研究得出结论：体外药敏数据支持使用两性霉素B序贯伊曲康唑、伏立康唑或泊沙康唑来治疗播散性Emergomyces病。氟康唑是效力相对较弱的药物。对于需要在参考实验室进行流行病学监测的情况，推荐使用酵母相以及商业Etest法或参考BMD法来测定E. africanus的MIC。

本研究的科学价值在于，首次系统性地报告了大规模E. africanus临床分离株（酵母相和霉菌相）的抗真菌药敏谱，填补了对于这一新发重要病原体治疗基础数据的空白。其应用价值直接体现在为临床医生，特别是南非等流行地区的医生，提供了基于实验室证据的治疗选择指导：优先推荐使用强效的三唑类药物（伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑）作为两性霉素B后的序贯口服治疗，而非效力较弱的氟康唑，尽管后者在南非更易获得。此外，研究明确排除了棘白菌素和氟胞嘧啶的治疗价值，避免了临床资源的误用。

六、 研究亮点

1. 研究对象新颖且重要：聚焦于新近命名、在南非艾滋病患者中高病死率的新发双相真菌病原体E. africanus，研究具有重要的公共卫生和临床意义。
2. 数据全面系统：研究纳入了50株临床分离株，是当时关于该病原体最大规模的药敏研究。同时测试了酵母相和霉菌相，提供了更全面的生物学视角。
3. 方法学细致且实用：针对缺乏标准化方法的双相真菌，研究在遵循CLSI指南的基础上，合理调整了接种物浓度和孵育时间，确保了实验可行性。同时比较了BMD和Etest两种方法，为不同条件的实验室提供了操作建议。
4. 临床与实验室数据结合：不仅提供了体外药敏数据，还初步探索了药敏结果、感染部位与患者临床结局的关联，将基础研究与临床实际问题联系起来。
5. 明确的临床推荐：基于坚实的体外数据，给出了清晰、具体的治疗药物推荐和实验室检测建议，对指导临床实践具有直接参考价值。

七、 其他有价值内容

研究还简要讨论了E. africanus的分类学背景，指出其隶属于Ajellomycetaceae科，与组织胞浆菌、芽生菌等亲缘关系相近，但不同于引起adiastromycosis的传统Emmonsia属真菌。这有助于读者理解该病原体在真菌学中的定位。此外，作者坦诚指出了研究的局限性，如部分患者临床数据缺失、无法完全排除院外用药的影响、使用了大于推荐标准的接种物等，体现了研究的严谨性。最后，研究强调，尽管尚无官方判读折点，但在缺乏临床治疗经验的背景下，体外MIC数据对于指导临床决策至关重要。