单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术在生物医学研究和临床应用中的数据分析指南

作者及发表信息
本文由Min Su（南京医科大学生殖医学国家重点实验室）、Tao Pan（海南医学院第一附属医院生物医学信息与工程学院）、Qiu-Zhen Chen（南京医科大学）、Wei-Wei Zhou（哈尔滨医科大学生物信息科学与技术学院）等来自中国、澳大利亚多所研究机构的学者共同完成，于2022年发表在*Military Medical Research*期刊（卷9期68），采用知识共享许可协议（CC BY 4.0）开放获取。

研究背景与目标
单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术通过解析单个细胞的转录组异质性，为疾病机制研究和临床诊疗策略开发提供了前所未有的分辨率。然而，随着高通量scRNA-seq技术的普及（如10× Genomics和Singleron平台），海量数据的分析成为非生物信息学背景研究者的主要障碍。本文旨在：（1）系统总结scRNA-seq数据分析流程中的算法进展与性能评估；（2）针对生物医学研究场景提供定制化分析工具推荐；（3）通过GitHub开源分析脚本（https://github.com/wxlab-njmu/scrna-recom）降低技术门槛。

核心内容框架

一、实验设计与数据预处理
1. 实验设计考量
- 样本来源：需明确物种（如人源/小鼠）、组织类型（实体瘤/PBMCs/类器官）和实验设计（病例-对照/队列研究）。例如，COVID-19研究采用健康人群作为对照，而肝癌研究常对比癌与癌旁组织。
- 批次效应控制：建议采用嵌套病例-对照设计或样本多重标记技术（如Cell Hashing）减少批次差异。

1. 原始数据处理
   

• 标准化流程：推荐使用Cell Ranger（10× Genomics）或Celescope（Singleron）生成UMI（Unique Molecular Identifier）计数矩阵，第三方服务通常提供质控后数据。
  
• 质量控制（QC）：
  
  • 细胞过滤：基于三个核心指标——总UMI数（计数深度）、检测基因数、线粒体基因占比。Seurat和scater包可实现交互式阈值设定，DoubletFinder被推荐用于双细胞检测（准确率最高）。
    
  • 环境RNA校正：Soupx和CellBender可有效去除背景噪音。

二、基础分析流程
1. 表达标准化
- 全局缩放方法：TPM（Transcripts Per Million）和scran的池化策略（pooling cells）优于传统bulk RNA-seq方法（如DESeq2），后者因零膨胀问题不适用单细胞数据。
- 生物协变量校正：sctransform通过正则化负二项回归实现方差稳定，Seurat的线性回归可消除细胞周期影响。

1. 数据整合
   

• 批次校正工具性能比较：
  
  • Harmony：运算速度快，适合初步探索
    
  • Seurat3/4 CCA：平衡批次混合与细胞群纯度
    
  • LIGER：基于非负矩阵分解（NMF），擅长复杂批次效应处理
    
• 评估指标：KBET（K-nearest-neighbor batch-effect test）量化整合效果。

1. 特征选择与降维
   

• 高变基因（HVGs）筛选：基于基因表达变异系数与技术噪音的关系，推荐选取1000-5000个HVGs。
  
• 降维方法：
  
  • 线性方法：PCA（主成分分析）结合”肘部法则”确定保留主成分数
    
  • 非线性可视化：UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）在保留全局结构上优于t-SNE
    

三、高级分析模块
1. 细胞亚群解析
- 聚类算法：Seurat的社区检测法和SC3（Single-Cell Consensus Clustering）表现最佳，后者通过k-means整合多聚类结果。
- 细胞注释策略：
- 标记基因法：CellMarker和PanglaoDB数据库提供13,000+标记基因，SCINA通过EM算法实现半自动注释
- 参考转录组法：SingleR匹配Human Cell Atlas等参考数据集
- 机器学习法：SingleCellNet随机森林分类器适用于已知细胞类型

1. 轨迹推断与RNA速率
   

• 拓扑结构选择：
  
  • 线性轨迹：SCORPIUS
    
  • 分支结构：Slingshot和Monocle
    
  • 复杂网络：PAGA（Partition-based Graph Abstraction）
    
• 动态分析：scVelo通过未剪接/剪接转录本比值预测细胞状态转换方向。

1. 细胞互作与调控网络
   

• 配体-受体（LR）数据库：CellPhoneDB（v4含2000+互作）和CellTalkDB覆盖人/鼠物种。
  
• 互作预测工具：
  
  • NicheNet：整合信号通路与基因调控网络
    
  • CellChat：基于空间邻近性验证互作强度
    
• 转录因子（TF）活性：SCENIC（Single-Cell Regulatory Network Inference）通过共表达模块与motif分析推断调控元（regulon）。

四、代谢与功能分析
1. 代谢通量建模：
- 路径富集：scMetabolism包支持ssGSEA和AUCell算法
- 通量平衡分析（FBA）：
- SC-FBA：基于Recon2模型构建代谢网络
- scFEAs：图神经网络解决非线性优化问题

1. 功能注释：
   

• GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）分析差异表达基因
  
• VISION和Pagoda2实现单细胞水平通路活性评分
  

研究意义与创新点
1. 方法论价值：
- 首次系统比较了16种细胞互作资源和7种预测工具的效能差异，揭示现有方法的不一致性
- 提出”先Harmony快速筛查，后LIGER精细整合”的分层分析策略

1. 临床应用指导：
   

• 针对肿瘤微环境研究，推荐联合使用CellChat和scFEAs解析代谢-免疫交叉对话
  
• 提供COVID-19重症患者免疫细胞regulon分析的标准化流程
  

1. 技术前瞻性：
   

• 展望了单细胞多组学（如scATAC-seq）整合、Live-seq活细胞时序分析等新兴方向
  
• 强调空间转录组（如Squidpy）在验证细胞互作中的金标准地位
  

本文通过”干湿结合”的视角，为生物医学研究者构建了从原始数据到生物学发现的完整分析路径，其开源脚本库将持续更新以纳入最新算法进展。