本次介绍的研究由中国首都医科大学宣武医院和天津医科大学总医院的研究人员完成，发表于2022年的《Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism》。这是一项利用单细胞RNA测序技术揭示小鼠缺血性脑卒中模型（大脑中动脉阻塞模型，Middle Cerebral Artery Occlusion， MCAO）中全脑细胞转录组图谱的原创性研究。
学术背景 缺血性脑卒中是一种破坏性的神经系统疾病，治疗选择有限。由于中枢神经系统（CNS）的细胞异质性，长期以来，明确大脑细胞亚群在卒中发生和发展中的作用一直是一项挑战。传统的转录组研究通常基于细胞混合的批量组织样本，这掩盖了疾病最敏感细胞亚群中关键的基因表达谱变化。单细胞RNA测序技术的出现，为在单细胞水平上解析卒中后复杂的细胞异质性和分子变化提供了前所未有的机会。本研究旨在利用单细胞RNA测序，全面绘制MCAO模型小鼠的细胞群体图谱，以期在单细胞分辨率上阐明急性缺血性卒中阶段神经炎症的精确转录变化，识别潜在的易感细胞类型、新型生物标志物和亚型特异性分子，为深入探索疾病机制和药物发现开辟新领域。
详细研究流程 本研究采用了一套严谨的实验与生物信息学分析流程。
第一阶段：动物模型与样本制备 首先，研究使用了成年小鼠建立MCAO模型以模拟缺血性脑卒中，并以假手术小鼠作为对照。研究选择在缺血再灌注后24小时这一急性期采集左侧大脑半球样本，这符合卒中突发、发展迅速、治疗时间窗窄的临床特征，使得早期干预阶段的分子变化研究尤为重要。动物实验程序均遵循相关指南并获伦理委员会批准。为了无偏倚地捕获所有细胞类型，研究者在没有使用可能在某些特定群体中差异表达的细胞表面标记物的情况下，分别从MCAO组和假手术组小鼠的脑中分离了所有单细胞。
第二阶段：单细胞RNA测序与数据生成 使用10x Genomics平台进行单细胞RNA测序。研究者共获得了58，528个单细胞，平均每个细胞检测到1,295个基因和2,610个独特的分子标识符。数据经过严格的质量控制，并利用Seurat 3软件包进行了批次效应校正。随后，使用t-分布随机邻域嵌入（t-SNE）降维技术将所有单细胞投影到二维空间进行可视化。
第三阶段：主要细胞类型鉴定与异质性分析 基于已知的细胞类型标记基因，研究人员从所有单细胞中鉴定出了17个主要的转录组学上不同的细胞簇。这些细胞类型包括：血管平滑肌细胞（SMC）、周细胞（PC）、血管周围成纤维样细胞（FB）、静脉内皮细胞（VEC）、毛细血管内皮细胞（Capec）、动脉内皮细胞（AEC）、脉络丛毛细血管内皮细胞（CPC）、中枢神经系统相关巨噬细胞（CAM）、单核细胞来源的细胞（MDC）、小胶质细胞（MG）、中性粒细胞（Neut）、星形胶质细胞（ASC）、少突胶质细胞（OLG）、室管膜细胞（EPC）、神经祖细胞（NPC）、淋巴细胞（Lym）和红细胞（RBC）。通过小提琴图展示了各细胞簇的标志性基因表达，并通过富集分析揭示了各细胞类型特异或共享的生物学功能。
第四阶段：缺血损伤相关差异表达基因（DEGs）与通路分析 为了探究卒中发病机制中涉及的DEGs及相关通路，研究者在每个已鉴定的细胞类型内部，对比了MCAO组与假手术组之间的基因表达变化。分析发现，小胶质细胞中鉴定出的DEGs数量最多（共275个），突出了其作为大脑固有免疫细胞在卒中后神经炎症中的核心地位。进一步，对各细胞类型DEGs的富集分析揭示了细胞类型特异性的通路改变，例如：小胶质细胞中的中性粒细胞趋化与凋亡信号通路；星形胶质细胞中的信号转导；少突胶质细胞中的神经元凋亡过程调节；内皮细胞中的阴离子及小分子转运；室管膜细胞中的类固醇激素反应等。研究还发现，卒中后大脑中多个细胞类型上调表达了多种趋化因子（如CCL7， CCL12， CCL4等），为卒中后的炎症反应提供了分子和细胞基础证据。
第五阶段：细胞类型特异性及共享的基因表达变化 分析显示，卒中后鉴定出的大量DEGs以细胞类型依赖的方式发生变化。值得注意的是，单细胞水平与模拟的批量组织水平DEGs对比显示，约80%的单细胞类型特异性DEGs在批量分析中无法被检测到，这凸显了单细胞测序在揭示稀有细胞类型及其关键调控基因方面的巨大优势。研究识别出多个细胞类型特异性DEGs，例如：小胶质细胞中特异性下调的稳态标记基因P2RY12，以及特异性上调的LPL和CD72基因；星形胶质细胞中主要上调的反应性胶质增生关键标志物GFAP。同时，也识别了跨越多个细胞类型的共享DEGs，如与神经保护相关的SPP1（骨桥蛋白），与神经退行性疾病相关的小胶质细胞富集基因LILRB4A，中性粒细胞浸润相关基因CXCL2等。研究还通过免疫荧光染色和流式细胞术在蛋白质水平验证了部分关键DEGs（如OLG中的GPD1， PC中的CCL11， MG中的CD72和LILRB4）的表达变化。
第六阶段：小胶质细胞亚群异质性及调控网络分析 作为大脑常驻免疫细胞，小胶质细胞在卒中中发挥关键作用。本研究在单细胞分辨率下将小胶质细胞进一步划分为5个独特的亚群（MG0-MG4）。MG0主要来源于假手术组，而MG2、3、4主要来源于MCAO组。各亚群具有独特的基因表达特征：MG1表达单核细胞趋化蛋白家族基因（CCL12， CCL2， CCL7）和缺氧相关基因IER3；MG2作为最具炎症性的卒中相关亚群，高表达与神经退行相关的小胶质细胞亚群共有基因（如LGALS3， LILRB4， LPL， SPP1）以及破坏血脑屏障的MMP12；MG3高表达干扰素（IFN）信号通路基因（如ISG15， IFIT3， IRF7）；MG4则表达与增殖相关的标记基因（如BIRC5， UBE2C），表明其为一群增殖中的小胶质细胞。研究通过流式细胞术和免疫组化对部分亚群（以Ccl2， Lgals3， Cxcl10为标志）进行了验证。此外，应用SCENIC（单细胞调控网络推断和聚类）分析揭示了各亚群特异的转录因子调控网络，例如在MCAO组为主的亚群中，缺氧传感器HIF1A以及转录因子SPI1的调节子活性增强。
第七阶段：其他免疫细胞及大脑血管细胞的异质性分析 研究还对其他细胞群体进行了深入的亚群分析。1）CNS边界相关巨噬细胞（CAMs）：鉴定出6个亚群，其中CAM4（主要来自MCAO组）高表达MHC II类抗原呈递分子，CAM5特征为氧化磷酸化相关基因高表达。2）单核/巨噬细胞（Mon/Mu）：提取了HSC来源的髓系细胞进行再聚类，揭示了包括Mo/Mu_Spp1， Mo_Cxcl2， Ly6Chi Mo， Ly6Clo Mo， Res-like Mu， MHC II Mu， IFNic Mo在内的多个功能状态亚群。利用Monocle 2软件进行的拟时序轨迹分析显示，单核/巨噬细胞在卒中后存在三个潜在的分化轨迹分支，不同亚群占据不同的分支位置，揭示了其动态变化过程。3）中性粒细胞：鉴定出4个亚群，包括最成熟、大量浸润的Neut0（高表达CXCL1等动员信号），特征为I型干扰素刺激基因高表达的Neut1，以及表达早期分化标记的Neut3。4）血管系统细胞：对内皮细胞（ECs）、平滑肌细胞（SMCs）、周细胞（PCs）、血管周围成纤维样细胞（FBs）进行了亚聚类，发现尽管各亚群细胞比例在卒中后变化不大，但缺血损伤上调或下调了每个亚群中大量编码炎症因子的基因，并发现了与血脑屏障功能障碍、I型干扰素反应等相关的特定亚群。
第八阶段：缺血性脑卒中改变脑内细胞间通讯 基于CellPhoneDB数据库，研究者推断了卒中前后脑内潜在的细胞-细胞通讯网络。在假手术组，细胞间相互作用主要由FB主导。而在MCAO组，小胶质细胞和CAM主导的相互作用显著增加，特别是小胶质细胞与其他免疫细胞、星形胶质细胞、周细胞和少突胶质细胞之间的预测相互作用。分析发现，卒中后特有的相互作用涉及大量趋化因子、细胞因子和TNF家族配体-受体对（如CCL2， CCL5， IL1A， TNF等）。特别值得注意的是，研究发现了一种新的小胶质细胞-淋巴细胞相互作用：由巨噬细胞/活化小胶质细胞表达的SPP1与CD8+ T细胞上的受体PTGER4之间的相互作用，并在脑切片中通过共聚焦显微镜观察证实了SPP1+小胶质细胞与PTGER4+ CD8+ T细胞在梗死周边区的共定位。
主要结论与意义 本研究通过单细胞RNA测序，首次在单细胞转录组水平上绘制了缺血性脑卒中急性期（再灌注后24小时）的全脑细胞图谱，前所未有地揭示了大脑细胞的表型异质性，并识别了卒中后急性阶段细胞功能的多样化改变。研究的主要结论包括：1）全面鉴定了卒中大脑中的17种主要细胞类型及其多个功能亚群；2）揭示了细胞类型特异性的差异表达基因和通路改变，其中小胶质细胞在神经炎症中占据主导地位，并表现出超越经典M1/M2分型的五种不同功能状态；3）阐明了浸润的单核/巨噬细胞、中性粒细胞等外周免疫细胞的高度异质性及其潜在的分化轨迹；4）描绘了大脑血管系统细胞（内皮细胞、平滑肌细胞等）在卒中后的转录组变化；5）揭示了卒中如何重塑脑内的细胞间通讯网络。这项研究为深入探索缺血性脑卒中的分子和细胞发病机制提供了宝贵的大规模数据资源。识别出的细胞类型特异性基因和跨细胞类型共享的易感靶点，有望作为动态疾病监测的生物标志物或未来干预治疗的新靶点，为基于细胞亚型特异性分子的卒中疾病机制探索和药物发现开辟了新领域。
研究亮点 1. 研究手段新颖：这是首次应用单细胞RNA测序技术全面探索成年缺血性脑损伤大脑中不同脑细胞的转录组模式及单个细胞基因表达特性的研究之一，技术先进。 2. 发现具有突破性：研究突破了小胶质细胞简单的M1/M2二分法极化范式，在体内卒中模型中鉴定出五个功能各异的小胶质细胞亚群，并解析了其特异的转录调控网络。 3. 分析全面深入：不仅关注了常驻的小胶质细胞，还对浸润的各类免疫细胞（单核/巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）以及大脑血管系统细胞、室管膜细胞等进行了细致的亚群划分和功能解析，提供了全景式的细胞图谱。 4. 整合细胞互作分析：通过生物信息学方法推断并对比了卒中前后脑内细胞间通讯网络的变化，将细胞层面的转录变化置于细胞相互作用的背景下理解，发现了新的潜在相互作用对（如SPP1-PTGER4）。 5. 数据验证严谨：在单细胞转录组发现的基础上，利用免疫荧光、流式细胞术等多种实验技术对关键差异表达基因和细胞亚群进行了蛋白质水平和细胞表型的验证，增强了结论的可靠性。
其他有价值的补充 研究在讨论部分也坦诚地指出了其局限性：1）研究结果受样本采集时间点（仅急性期24小时）和动物模型严重程度的影响，卒中后的炎症反应是一个动态过程，后期阶段的转录组景观有待研究；2）研究使用的是年轻成年小鼠，而卒中多发于老年人，衰老大脑对卒中的反应可能存在差异；3）动物模型研究在揭示人类疾病机制方面存在固有局限性。这些思考为未来的研究方向提供了清晰的指引，例如开展多个时间点的动态监测、研究老年动物模型、以及探索利用卒中患者手术样本或捐献脑组织进行单细胞研究等。这些后续工作将有助于进一步阐明卒中的复杂机制。