关于雷公藤红素（Celastrol）在脑缺血-再灌注损伤中神经保护作用及直接靶向HMGB1蛋白机制的研究报告

一、 研究团队、发表信息及学术背景

本研究由刘丹丹、罗飘、顾立伟、张倩、高鹏、朱永平、陈晓、郭秋艳、张俊哲、马楠*和王继刚*等研究人员共同完成。研究团队主要来自中国中医科学院中药研究所青蒿素研究中心，部分合作者来自中国药科大学、暨南大学、南方医科大学、广西医科大学、赣南医学院以及深圳市人民医院等机构。这项原创性研究成果以题为“Celastrol exerts a neuroprotective effect by directly binding to hmgb1 protein in cerebral ischemia–reperfusion”的论文形式，于2021年发表在期刊《Journal of Neuroinflammation》（J Neuroinflammation）上。

本研究属于神经科学、药理学和化学生物学的交叉领域，聚焦于脑卒中（中风）治疗这一重大医学挑战。脑缺血-再灌注（Ischemia-Reperfusion, I/R）损伤是缺血性卒中后血流恢复导致继发性脑损伤的关键病理过程，而神经炎症在其中扮演了核心角色。高迁移率族蛋白B1（High Mobility Group Protein 1, HMGB1）作为一种重要的损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Pattern, DAMP）分子，在脑I/R损伤中被大量释放，通过激活Toll样受体4（TLR4）和晚期糖基化终末产物受体（RAGE）等，加剧炎症反应，导致神经元死亡。因此，靶向HMGB1介导的炎症通路被视为极具潜力的卒中治疗策略。

雷公藤红素（Celastrol, Cel）是从传统中药雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）中提取的活性成分，前期研究已显示其具有抗炎、抗氧化、神经保护等多种药理活性，并在多种神经系统疾病模型中展现出治疗潜力。然而，其在脑I/R损伤中的具体作用靶点及分子机制尚不完全清楚，特别是其是否以及如何直接作用于HMGB1这一关键炎症介质，缺乏直接证据。

基于此，本研究旨在：1）明确Cel在脑I/R损伤模型中的神经保护作用；2）利用先进的化学生物学技术，系统性鉴定Cel在神经元中的直接作用靶点；3）重点阐明Cel与HMGB1蛋白的直接相互作用及其对HMGB1促炎活性的影响机制；4）探索Cel通过其他靶点（如HSP70、NF-κB p65）发挥作用的途径。研究的目标是为Cel治疗缺血性卒中提供坚实的实验依据和新的作用机制见解。

二、 详细研究流程与方法

本研究设计严谨，综合运用了体内外模型、化学生物学靶点鉴定、生物物理验证及分子细胞生物学技术，流程可分为以下几个关键步骤：

1. 模型建立与药效验证： * 体外模型： 采用原代大鼠皮层神经元，构建氧糖剥夺（Oxygen-Glucose Deprivation, OGD）模型以模拟脑I/R损伤。通过细胞活力检测（CCK-8法）评估Cel及其探针（Cel-p）的神经保护作用，确定最佳给药浓度（0.1-0.8 μM）和时间窗口（OGD后连续给药48小时）。 * 体内模型： 采用成年雄性SD大鼠，构建大脑中动脉阻塞（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）模型。通过神经功能缺损评分（Zea-Longa评分）、脑梗死体积测定（TTC染色）和尼氏染色观察神经元形态，评估Cel（1 mg/kg，腹腔注射）的神经保护效果，并以依达拉奉（Edaravone）作为阳性对照。

2. 活性探针（Cel-p）的构建与验证： * 探针合成： 在Cel的羧基末端引入炔基手柄，合成了具有生物正交反应活性的Cel探针（Cel-p），旨在保留母体化合物生物活性的前提下，用于后续靶点捕获与鉴定。 * 探针验证： 通过细胞毒性实验证实Cel-p与Cel的半数抑制浓度（IC50）相近，表明探针保留了Cel的生物活性。在OGD模型中，Cel-p表现出与Cel相似的神经保护效果。通过浓度依赖性和竞争性标记实验（结合点击化学与荧光扫描），证实Cel-p能高效标记活神经元内的蛋白质，且其标记可被过量的Cel竞争性抑制，说明Cel-p能真实反映Cel的细胞内结合情况。细胞成像显示Cel-p可进入细胞质和细胞核。

3. 定量化学蛋白质组学靶点鉴定： * 样品处理： 将原代神经元分为三组：Cel-p处理组、Cel-p + 过量Cel竞争组、以及正常/OGD模型背景组。使用Cel-p（4 μM）孵育细胞4小时，通过点击化学反应将生物素标签连接到Cel-p结合的蛋白质上。 * 亲和纯化与质谱分析： 利用链霉亲和素琼脂糖珠富集生物素标记的蛋白质复合物。将捕获的蛋白质进行酶解，所得肽段使用串联质量标签（Tandem Mass Tag, TMT）进行同位素标记，然后进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。 * 数据分析： 通过比较Cel-p单独处理组与Cel-p+Cel竞争组的蛋白质丰度比值，筛选出被Cel特异性结合的潜在靶点蛋白。设定富集比>1.5且p<0.05为显著性标准。

4. 靶点验证与机制研究： * HMGB1的直接结合验证： * 下拉验证与免疫印迹（Western Blot, WB）： 使用Cel-p进行细胞裂解液下拉实验，WB检测HMGB1，证实Cel可竞争性抑制Cel-p与HMGB1的结合。 * 免疫荧光共定位： 在活神经元中，显示Cel-p与HMGB1抗体信号共定位，且此共定位可被过量Cel消除。 * 细胞热位移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）： 该技术基于药物结合可稳定靶蛋白、使其在加热时不易降解的原理。实验发现，Cel处理能显著提高HMGB1蛋白的热稳定性，直接证明了Cel与HMGB1在细胞裂解物中的结合。 * Cel对HMGB1表达、分泌及氧化还原状态的影响： * 表达水平： 通过WB检测发现，Cel处理并不影响神经元在正常或OGD条件下HMGB1的总蛋白表达水平。 * 亚细胞定位： WB检测胞浆和核蛋白组分，发现OGD损伤后HMGB1从细胞核向胞浆转移，而Cel对此转移过程影响有限。 * 分泌与形态： 收集神经元培养上清并浓缩，通过非还原性电泳检测HMGB1的氧化还原形态。发现OGD损伤后，神经元主要分泌具有二硫键的HMGB1（disulfide HMGB1）亚型，而Cel处理并不改变HMGB1的分泌量及其氧化还原状态（即不改变二硫键型与完全还原型的比例）。 * Cel与HMGB1结构域的相互作用研究： * 重组蛋白结合实验： 表达并纯化了人源HMGB1的A box（1-89位氨基酸）和B box（90-175位氨基酸）结构域。通过点击化学荧光标记实验，证明Cel能直接、浓度依赖性地与全长HMGB1、A box及B box结合。 * 结合位点探究： 使用半胱氨酸（Cys）烷基化试剂IAA-yne进行竞争实验。发现Cel能几乎完全竞争掉IAA-yne与HMGB1（无论是二硫键型还是二硫苏糖醇DTT还原后的型）的结合，提示Cel可能结合在HMGB1的关键Cys位点（Cys23, Cys45, Cys106）上。然而，Cel-p与A/B box的结合不能被IAA完全阻断，说明Cel除了结合Cys，还可能结合HMGB1的其他位点。 * Cel对HMGB1促炎活性的影响： * 细胞因子诱导实验： 使用RAW 264.7巨噬细胞系。用重组人HMGB1蛋白或其B box结构域刺激细胞，可诱导肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌，模拟其促炎活性。预孵育Cel能显著抑制HMGB1或B box诱导的TNF-α产生。 * 受体结合阻断实验： 将重组B box与Cel预孵育形成复合物，再与神经元裂解液共孵育，通过镍柱下拉B box（带His标签）及其结合蛋白。WB检测发现，Cel处理能显著减少与B box结合的TLR4和RAGE受体蛋白的量。 * Cel对其他通路靶点的影响： * HSP70与NF-κB p65： 在OGD体外模型和MCAO体内模型中，通过WB和免疫荧光检测发现，Cel处理能显著上调热休克蛋白70（HSP70）的表达，并下调核因子κB p65亚基（NF-κB p65）的核转位及总表达水平。这表明Cel的神经保护作用也涉及对HSP70和NF-κB通路的调控。

5. 数据分析： 所有定量数据以均值±标准误表示。使用GraphPad Prism软件进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用Fisher最小显著性差异法。P值小于0.05认为具有统计学显著性。

三、 主要研究结果

1. Cel及其探针Cel-p在脑I/R损伤模型中均表现出明确的神经保护作用。 在体外，Cel和Cel-p能浓度依赖性地提高OGD损伤后原代神经元的存活率。在体内，Cel治疗能显著减少MCAO大鼠的脑梗死体积，改善神经功能缺损评分，并减轻皮层神经元的尼氏体损伤，其效果与阳性药依达拉奉相当。

2. 通过定量化学蛋白质组学成功鉴定出Cel的直接结合靶点，其中HMGB1是可信度最高的靶点之一。 质谱分析共鉴定出1405个蛋白质，其中120个为高可信度靶点。下拉实验、WB、免疫荧光共定位及CETSA等多种技术相互印证，确证了Cel能与HMGB1蛋白发生直接相互作用。

3. Cel不改变HMGB1的表达、分泌及氧化还原状态，而是通过直接结合来抑制其促炎活性。 研究发现，Cel处理不影响神经元内HMGB1的总蛋白量，也不改变OGD诱导的HMGB1胞外分泌量及其主要的二硫键氧化还原形态。关键在于，Cel能直接结合HMGB1蛋白，特别是其B box结构域。

4. Cel通过占据HMGB1 B box的关键位点，阻断其与炎症受体TLR4/RAGE的结合，从而抑制下游炎症信号。 实验证实，Cel能结合HMGB1的Cys残基（包括关键位点Cys106）。功能实验显示，Cel与HMGB1或单独B box预孵育后，它们诱导巨噬细胞产生TNF-α的能力被显著削弱。机制上，Cel与B box结合后，阻碍了B box与炎症受体TLR4和RAGE的相互作用。

5. Cel的神经保护作用还涉及对HSP70和NF-κB通路的调节。 在OGD和MCAO模型中，Cel能上调保护性蛋白HSP70的表达，同时抑制促炎转录因子NF-κB p65的活化和核转位。这为Cel的抗炎效应提供了额外的机制解释。

四、 研究结论与意义

本研究的核心结论是：雷公藤红素（Cel）通过直接结合高迁移率族蛋白B1（HMGB1），并靶向热休克蛋白70（HSP70）和核因子κB p65（NF-κB p65），在脑缺血-再灌注损伤中发挥神经保护和抗炎作用。

具体而言： * 直接靶向机制： Cel直接与HMGB1蛋白，尤其是其B box结构域结合。这种结合不改变HMGB1的释放和氧化状态，而是通过空间位阻效应，阻断HMGB1 B box与TLR4和RAGE受体的结合，从而抑制HMGB1作为警报素（alarmin）触发的下游促炎信号通路（如TNF-α释放）。 * 多重作用通路： 除了直接抑制HMGB1的活性，Cel还能上调细胞内保护性蛋白HSP70的表达，并抑制核心促炎转录因子NF-κB的活化。这构成了Cel发挥神经保护作用的双重或多重机制。 * 科学价值： 本研究首次利用基于活性探针（Cel-p）的定量化学蛋白质组学技术，在脑I/R损伤的背景下系统性地绘制了Cel的潜在作用靶点图谱，并首次提供了Cel直接结合并功能性抑制HMGB1蛋白的确凿实验证据。这深化了对Cel药理作用机制的理解，特别是揭示了其干预DAMP分子信号的新方式。 * 应用潜力： 该研究为将Cel或其结构优化衍生物开发为治疗缺血性脑卒中的候选药物提供了重要的临床前依据。阐明的以HMGB1为直接靶点的作用机制，为针对卒中后神经炎症的治疗策略提供了新的思路和药物作用模板。

五、 研究亮点

1. 技术方法的创新性与系统性： 研究巧妙地合成了具有生物活性的Cel探针（Cel-p），并将其与TMT标记定量蛋白质组学、CETSA、点击化学标记、竞争性结合实验等一系列前沿的化学生物学和分子生物学技术相结合，形成了一套从“全蛋白组范围内无偏性发现靶点”到“多维度验证靶点相互作用及功能”的完整技术链条，研究策略先进、证据链完整。
2. 靶点发现的直接性与突破性： 首次直接证实了Cel与HMGB1蛋白的物理结合，并精细定位到其作用可能涉及B box结构域及关键Cys残基。这一发现超越了以往仅停留在信号通路变化层面的研究，明确了Cel的直接作用靶点之一。
3. 机制阐释的深度： 不仅证明了“结合”，还深入阐明了“如何结合”以及“结合后如何影响功能”。研究明确了Cel是通过“占据结合位点、阻断受体互作”的方式来中和HMGB1的促炎活性，而非通过影响其表达或分泌，这为理解小分子药物中和细胞因子活性提供了新颖的机制视角。
4. 疾病模型的关联性： 所有关键机制验证均在OGD（体外）和MCAO（体内）这两种经典的脑I/R损伤模型中进行，确保了研究发现与疾病病理过程的高度相关性，增强了结论的生理和病理意义。
5. 研究结论的综合性： 研究并未将结论局限于单一靶点，而是整合了直接靶点（HMGB1）和间接调控靶点（HSP70, NF-κB）的证据，全面描绘了Cel在脑I/R损伤中复杂的神经保护网络，使其机制阐释更为立体和可信。

六、 其他有价值的内容

研究在讨论部分也指出了当前研究的局限性及未来方向：例如，Cel及其众多衍生物虽具有治疗潜力，但因毒性、溶解性及治疗窗窄等问题尚未获批临床使用，如何降低毒性、提高疗效是下一步研究方向。此外，作者提到炎症在卒中不同阶段作用复杂，HMGB1除促炎外，在轴突再生、血管修复等方面也可能有有益作用，因此需要仔细权衡在不同卒中阶段干预HMGB1的利弊。这些思考体现了研究的深度和前瞻性。