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一、研究作者、机构与发表信息
本研究由来自俄罗斯和台湾的多个研究机构合作完成。主要通讯作者为俄罗斯科学院乌法联邦研究中心的Lidia A. Baltina和台湾中国医药大学的Cheng-Wen Lin。其他作者分别来自台湾中国医药大学药学院、医学检验生物技术学系、生物医学研究所、亚洲大学生物技术学系、中国医药大学附设医院肝胆胃肠科，以及俄罗斯巴什基尔国立医科大学。该研究成果发表于病毒学领域期刊《Virus Research》2021年第294卷，文章编号198290，于2020年12月31日在线发表，正式出版时间为2021年。
二、研究背景与目的
寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）是一种由伊蚊传播的新发病原性黄病毒，属于黄病毒科黄病毒属。寨卡病毒感染可导致严重的神经系统并发症，如格林-巴利综合征，对孕妇尤其危险，可能导致胎儿先天畸形和新生儿小头畸形。目前尚无获批的疫苗或特异性感染后治疗药物，现有治疗仅为支持性治疗。因此，开发针对寨卡病毒的新型抗病毒药物具有重要的公共卫生意义。
甘草酸（glycyrrhizic acid, GL）是甘草根部的主要生物活性三萜皂苷，已被证实对多种DNA和RNA病毒具有抑制活性，包括甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、SARS冠状病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、流感病毒等。甘草酸及其衍生物的抗病毒机制涉及病毒进入、融合、穿入、内吞以及复制后阶段等多种环节。本研究旨在探索甘草酸及其氨基酸酯类衍生物对寨卡病毒的体外抗病毒活性及作用机制，为开发新型抗寨卡病毒药物提供候选化合物。
三、研究设计与实验流程
本研究共设计和准备了20种甘草酸衍生物（化合物2至21），并根据分子结构分为四组：第I组（化合物2–10）为甘草酸与三个氨基酸甲酯残基的缀合物；第II组（化合物11–14）为糖链部分含有两个氨基酸甲酯残基的甘草酸缀合物；第III组（化合物15–17）为糖链部分含有两个氨基酸乙酯残基的缀合物；第IV组（化合物18–21）为糖链部分含有游离氨基酸残基的缀合物。第II–IV组化合物的三萜骨架C20位均保留游离羧基（COOH）。
实验所用细胞系包括人胶质瘤/星形细胞瘤细胞SF268、人肺上皮细胞A549、人横纹肌肉瘤细胞TE671，以及用于病毒扩增的BHK-21细胞。寨卡病毒株包括低剂量（MOI=0.05）的PRVABC59株和高剂量（MOI=10）的Natal RGN单轮感染性颗粒（single-round infectious particles, SRIPs）。Natal RGN株来源于小头畸形胎儿脑组织，通过合成和反向遗传技术拯救获得，并携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因。
实验流程主要包括以下环节：
细胞毒性测定：采用MTT法评估甘草酸衍生物对SF268和A549细胞的细胞毒性，测定半数细胞毒性浓度（CC50）。
抗病毒活性初筛：将SF268细胞以MOI=0.05感染寨卡病毒PRVABC59株，同时加入10 μM的各衍生物，孵育96小时后，通过显微镜观察细胞病变效应（cytopathic effect, CPE），并采用免疫荧光染色法检测病毒NS1蛋白阳性细胞比例，计算病毒感染抑制率。
半数抑制浓度（IC50）测定：对第II组和第III组衍生物进行浓度梯度（0、0.1、1、10 μM）处理，分别测定对PRVABC59株的CPE减少和NS1阳性率抑制，计算IC50值。同时使用TE671细胞验证化合物13的抗病毒活性。此外，在A549细胞中以高剂量（MOI=10）Natal RGN SRIPs感染，通过检测EGFP荧光强度分析化合物13和14的抗病毒活性。
时间添加/移除实验：将化合物13或14与病毒同时加入SF268细胞（进入阶段，0–2小时）或在感染后2小时加入并处理2小时（进入后阶段），孵育18小时后检测残余病毒感染性。另设预处理模式：细胞在接种病毒前用化合物预处理2小时，以分析其对病毒附着或宿主抗病毒因子产生的影响。
分子对接模拟：从RCSB蛋白质数据库下载寨卡病毒NS2B-NS3蛋白酶（PDB ID: 5H6V）、NS3解旋酶（PDB ID: 5Y6N）、NS5甲基转移酶（MTase，PDB ID: 5GOZ）和NS5 RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp，PDB ID: 5U04）的晶体结构，使用Biovia Discovery Studio 2019中的CDOCK程序进行分子对接，分析甘草酸及化合物13、14与病毒靶蛋白的相互作用模式。
数据统计分析采用单因素方差分析和Scheffe事后检验，P<0.05为显著性差异。
四、主要研究结果
细胞毒性与抗病毒活性筛选结果
MTT实验显示，大多数甘草酸衍生物对SF268和A549细胞的毒性较低，CC50大于50 μM。在10 μM浓度下，甘草酸及化合物11、12、13、14、15、16在CPE试验中表现出强抑制作用。进一步通过NS1阳性率检测发现，第II组和第III组衍生物的抗病毒活性显著高于第I组和第IV组。其中化合物13对病毒感染抑制率超过80%，化合物11、12、14、15、16的抑制率均大于70%。第I组化合物大多活性较低或无活性，提示三萜部分游离COOH基团对抗病毒活性至关重要。
IC50测定与选择性指数
化合物13（Asp(OMe)-OMe缀合物）和化合物14（TyrOMe缀合物）的IC50值分别为0.23±0.04 μM和0.09±0.02 μM，对低剂量PRVABC59株感染SF268细胞的抑制活性优于甘草酸（IC50=0.77±0.03 μM）。在A549细胞中，针对高剂量Natal RGN SRIPs感染，化合物13和14的IC50分别为1.20±0.46 μM和0.74±0.02 μM。化合物14的选择性指数（SI=CC50/IC50）为67.6~555.6，较甘草酸高8倍；化合物13的选择性指数为41.7~217，较甘草酸高3倍。在TE671细胞中，化合物13也表现出有效的抗寨卡病毒活性（IC50=0.43 μM），表明其抗病毒作用不依赖于特定细胞类型。
抗病毒机制研究
时间添加/移除实验显示，化合物13在病毒进入阶段的抑制活性更强，IC50值低于0.1 μM，而化合物14在进入后阶段的抑制活性更强，IC50为1.31±0.60 μM，优于化合物13的2.18±0.39 μM。在预处理模型中，化合物14（IC50=7.85±0.36 μM）的抑制效果高于化合物13（IC50>10 μM）。这些结果表明，化合物13主要阻断寨卡病毒进入宿主细胞的早期阶段，而化合物14主要干扰病毒进入后的复制阶段。糖链部分氨基酸甲酯残基的结构差异（天冬氨酸甲酯与酪氨酸甲酯）可能决定了化合物在不同病毒复制阶段的特异性作用。
分子对接结果
分子对接分析显示，甘草酸及化合物13和14均能很好地结合寨卡病毒NS5 MTase的活性位点口袋，但不能有效结合NS2B-NS3蛋白酶、NS3解旋酶或NS5 RdRp。化合物13的-CDOCKER相互作用能为96.2502，化合物14为88.4872，均高于甘草酸的86.6777，说明前两者与NS5 MTase的亲和力更强。甘草酸通过氢键与Arg213、Glu218、Asp146、Gly58结合，并通过电荷或疏水相互作用与Lys28、Phe24、Ser56、Arg213作用。化合物13通过氢键与Ser56、Arg57、Gly58、Glu111、Lys182、Ser215结合，并通过盐桥或疏水作用与Phe24、Arg41、Arg57、Gly81、Gly83、Trp87、Asp146、Ser150、Arg213、Glu218作用。化合物14则通过氢键与Ser56、Lys61、Glu111结合，并与Lys28、Arg57、Gly58、Gly81、Trp87、Arg213发生疏水相互作用。三萜部分的游离COOH基团对于与NS5 MTase活性位点内带正电荷残基（Lys28、Arg41、Arg57、Arg213）形成盐桥至关重要，这解释了第I组衍生物因缺乏游离COOH而活性较低的现象。同时，化合物13和14糖链部分的Asp(OMe)-OMe和TyrOMe残基与Phe24和Trp87等芳香残基形成烷基和π-烷基相互作用，进一步增强了结合稳定性。
五、研究结论与意义
本研究首次报道了甘草酸及其氨基酸酯衍生物对寨卡病毒的抗病毒活性。研究发现，甘草酸分子中三萜部分的游离COOH基团和糖链部分两个氨基酸甲酯残基对于提高抗寨卡病毒活性起关键作用，这些结构特征有利于与NS5 MTase活性位点的盐桥、氢键和烷基/π-烷基相互作用。化合物13和14是最有效的衍生物，具有较高的选择性指数和多重抗病毒作用机制，包括抑制病毒进入和进入后阶段。这些结果为将化合物13和14作为候选药物进行扩展抗病毒研究提供了科学依据，并为针对寨卡病毒感染的药物开发奠定了基础。
六、研究亮点
本研究的亮点在于：第一，首次系统评价了甘草酸及20种衍生物对寨卡病毒的抗病毒活性；第二，明确了结构-活性关系，即三萜部分游离COOH基团和糖链部分氨基酸甲酯残基的重要性；第三，通过时间添加/移除实验和分子对接模拟，揭示了化合物13和14分别作用于病毒进入和进入后阶段的不同机制；第四，化合物14表现出优异的选择性指数，具有进一步开发为抗寨卡病毒药物的潜力；第五，研究采用了包括低剂量和高剂量病毒株、多种人源细胞系及单轮感染性颗粒在内的多种实验体系，验证了候选化合物的广谱抗病毒活性。
七、其他有价值内容
本研究还涉及多种甘草酸衍生物的合成与纯化，包括首次合成的化合物18。所有化合物的纯度均达到95%以上，并通过IR、¹³C NMR和元素分析进行了结构确证。此外，研究使用的高剂量单轮感染性颗粒（SRIPs）系统为评价抗病毒药物在高病毒载量条件下的活性提供了更接近临床感染的体外模型。分子对接中鉴定的NS5 MTase活性位点结合模式为后续基于结构的药物优化提供了重要信息。